陳清嬋，簡(jiǎn)清梅，李 蓉，孫愛紅

（荊楚理工學(xué)院，生物工程學(xué)院，湖北荊門 448000）

以柑橘為原料釀造果酒，酒精度低，酒質(zhì)溫和爽口，果香味濃，基本保持了柑橘中的天然營養(yǎng)成分。湖北是柑橘生產(chǎn)區(qū)之一，柑橘業(yè)已成為湖北省農(nóng)業(yè)生產(chǎn)的支柱產(chǎn)業(yè)。因此充分利用湖北省的柑橘資源，釀造具有本地柑橘特色的果酒，為柑橘產(chǎn)業(yè)的發(fā)展開辟了一條新的道路。柑橘酒的香氣和味道對(duì)柑橘酒的品質(zhì)起著很大的作用，也是評(píng)價(jià)柑橘酒品質(zhì)的重要感官指標(biāo)。然而，柑橘酒的香氣和呈味并非是單一化合物的作用。酒中含有多種香氣物質(zhì)，主要包括醇類、醛類、酮類、酯類等，這些物質(zhì)的濃度從每升幾毫克到每升幾百毫克，正是這些物質(zhì)相互作用形成了酒的特征香氣。特征呈味是由多種呈味物質(zhì)，如有機(jī)酸、氨基酸、酚酸、單寧酸、糖類等物質(zhì)相互作用的結(jié)果，這些滋味物質(zhì)一部分來源于橘子本身，另一部分來源于發(fā)酵過程和陳釀老化階段。

目前，鑒定果酒中香氣、呈味物質(zhì)方法主要包括GC-MS法、GC-O法、頂空固相微萃取法、液液萃取法等。汪立平等[1]以頂空固相微萃取法和氣相色譜質(zhì)譜聯(lián)用，研究了蘋果酒香氣的快速提取方法。溫海祥、江東文等[2]利用液-液萃取法提取香蕉果酒中的揮發(fā)性香氣成分，用氣相色譜-質(zhì)譜(GC-MS)技術(shù)進(jìn)行分析。董曼、任婧楠等[3]研究了自然發(fā)酵和接種發(fā)酵樹莓酒中的香氣物質(zhì),并對(duì)其進(jìn)行感官分析，運(yùn)用GC-O檢測(cè)法確定特征香氣活性物質(zhì)。

本試驗(yàn)通過對(duì)從橘子果實(shí)上分離篩選出的天然野生優(yōu)良菌株和優(yōu)選的商業(yè)果酒酵母所釀造橘子酒的生香性能進(jìn)行比較研究，確定柑橘果酒的香氣組成及不同釀酒酵母對(duì)柑橘果酒香氣成分的影響。初步探討適合釀造柑橘果酒的酵母菌，為橘子酒生產(chǎn)菌種的選擇提供支持。

1 材料與方法

1.1 材料與儀器

材料與試劑：橘子，荊門本地產(chǎn)；白砂糖，武漢廣盛元食品有限公司；法國葡萄酒專用酵母FX10、安琪果酒酵母、高溫釀酒酵母，煙臺(tái)帝伯仕自釀機(jī)有限公司；酵母菌JZ-1和JZ-2，實(shí)驗(yàn)室篩選得到；亞硫酸（分析純），天津市東麗區(qū)天大化學(xué)試劑廠。

儀器設(shè)備：固相微萃取(SPME)裝置、手動(dòng)固相微萃取進(jìn)樣器、二乙烯基苯/碳分子篩/聚二甲基硅氧烷(DVB/CAR/PDMS)50/30 μm、20 mL頂空鉗口樣品瓶，美國 Supelco公司；Agilent 6890N/5975MSD氣質(zhì)聯(lián)用(GC-MS)儀，美國Agilent公司。

1.2 試驗(yàn)方法

1.2.1 橘子酒釀造工藝

橘子→去皮→打漿→過濾→橘子清汁→調(diào)糖→調(diào)SO2濃度→接種→發(fā)酵。

調(diào)糖：用白砂糖調(diào)整橘子汁糖度為20°Bx。調(diào)SO2：用亞硫酸調(diào)整SO2濃度為100 mg/L。

斜面酵母菌株的活化：用接種環(huán)取1環(huán)保存的斜面酵母轉(zhuǎn)接到PDA斜面培養(yǎng)基上，培養(yǎng)箱中28℃培養(yǎng)24～48 h，至酵母長滿斜面。

干酵母的活化：稱取0.02 g干酵母，置于調(diào)好的100 mL橘子清汁中，于30℃水浴鍋水浴活化15 min。

菌種擴(kuò)大培養(yǎng)：從活化斜面培養(yǎng)基上取1環(huán)活化菌種接入50 mL經(jīng)滅菌處理的橘子清汁中，28℃搖床培養(yǎng)24 h，振蕩速度120 r/min。

接種：分別將各菌株擴(kuò)大培養(yǎng)液按5%的體積比例接入到100 mL橘子清汁中。

發(fā)酵：放入25℃培養(yǎng)箱中恒溫發(fā)酵，發(fā)酵時(shí)間為7 d。

1.2.2 固相微萃取(SPME)法質(zhì)譜條件

取10 mL樣品置于20 mL鉗口瓶中，用聚四氟乙烯隔墊密封，于磁力攪拌器上在60℃加熱平衡15 min后，通過隔墊插入已活化好的SPME萃取頭(270℃活化30 min)，推出纖維頭，頂空吸附40 min后，插入GC進(jìn)樣口解析5 min。

色譜條件：色譜柱為DB-5 MS(30 m×0.25 mm，0.25 μm)；載氣：氦氣；柱流量：1 mL/min；進(jìn)樣口溫度：250℃，不分流進(jìn)樣；起始溫度40℃，保持3 min，以3℃/min升至160℃，再以8℃/min升至220℃，保持3 min。

質(zhì)譜條件：接口溫度280℃；離子源溫度230℃；四極桿溫度150℃；離子化方式：EI；電子能量70 eV；質(zhì)量范圍35～350 amu/s。

1.2.3 化合物鑒定及定量

定性分析：樣品揮發(fā)性化合物經(jīng)氣相色譜分離，不同組分形成其各自的色譜峰，用氣相色譜-質(zhì)譜-計(jì)算機(jī)聯(lián)用儀進(jìn)行分析鑒定。分析結(jié)果運(yùn)用計(jì)算機(jī)譜庫(NIST/WILEY)進(jìn)行初步檢索及資料分析，再結(jié)合文獻(xiàn)進(jìn)行人工譜圖解析，確認(rèn)揮發(fā)性化合物的各個(gè)化學(xué)成分。以歸一法計(jì)算各香氣物質(zhì)的峰面積，作為各香氣成分的相對(duì)含量。根據(jù)香氣物質(zhì)種類及含量比較各菌株的生香性能。

2 結(jié)果與分析

2.1 5種酵母菌釀造的橘子酒香氣組分

5種酵母釀造的橘子酒通過HS-SPME法分析后，所檢測(cè)的揮發(fā)性成分差異比較明顯。GC-MS鑒定出的橘子酒中揮發(fā)性成分及其相對(duì)質(zhì)量分?jǐn)?shù)見表1。

由表1可知，5種酵母菌發(fā)酵橘子酒的香氣成分經(jīng)GC-MS分析后，共檢出香氣成分38種，共6類化合物。安琪果酒酵母發(fā)酵橘子酒中檢出酯類12種，醇類4種，烯類12種，醛類2種，雜環(huán)類1種，酚類1種，共32種化合物。FX 10酵母發(fā)酵橘子酒中檢出酯類12種，醇類1種，烯類12種，醛類1種，酚類1種，共27種化合物。高溫釀酒酵母發(fā)酵橘子酒中檢出酯類8種，醇類1種，烯類12種，酚類1種，共22種化合物。JZ-1酵母發(fā)酵橘子酒中檢出酯類11種，醇類2種，烯類11種，酚類1種，共25種化合物。JZ-2酵母發(fā)酵橘子酒中檢出酯類9種，醇類1種，烯類10種，醛類1種，酚類1種，共22種化合物。安琪果酒酵母發(fā)酵橘子酒檢出物質(zhì)中相對(duì)質(zhì)量分?jǐn)?shù)較高的是1-戊醇（29.11%）、辛酸乙酯（21.72%）、乙酸異戊酯（9.1%）、苯乙醇（9.06%）、癸酸乙酯（8.36%）、正己酸乙酯（3.2%）、D-檸檬烯（3.88%）、乙酸苯乙酯（2.88%）；FX 10酵母發(fā)酵橘子酒中檢出的物質(zhì)中相對(duì)質(zhì)量分?jǐn)?shù)較高的有甲酸異戊酯（21.73%）、乙酸異戊酯（5.63%）、辛酸乙酯（15.45%）、乙酸苯乙酯（2.98%）、癸酸乙酯（8.22%）、苯乙醇（12.69%）、D-檸檬烯（3.82%）、3-蒈烯（14.04%）、(+)-樅油烯（2.8%）；高溫釀酒酵母發(fā)酵橘子酒中檢出的物質(zhì)中相對(duì)質(zhì)量分?jǐn)?shù)較高的有乙酸異戊酯（3.86%）、辛酸乙酯（5.92%）、乙酸苯乙酯（5.78%）、苯乙醇（37.66%）、D-檸檬烯（3.27%）；JZ-1酵母發(fā)酵橘子酒中檢出的物質(zhì)中相對(duì)質(zhì)量分?jǐn)?shù)較高的有乙酸異戊酯（10.32%）、正己酸乙酯（2.8%）、癸酸乙酯（11.82%）、苯乙醇（10.35%）、3-蒈烯（3.1%）；JZ-2酵母發(fā)酵橘子酒中檢出的物質(zhì)中相對(duì)質(zhì)量分?jǐn)?shù)較高的有乙酸異戊酯（4.06%）、辛酸乙酯（13.44%）、癸酸乙酯（3.84%）、苯乙醇（25.18%）、D-檸檬烯（2.18%）、3-蒈烯（4.16%）、(+)-樅油烯（2.04%）。

表1 5種酵母發(fā)酵橘子酒香氣成分的檢測(cè)

2.2 5種酵母發(fā)酵橘子酒香氣成分分析

比較5種酵母發(fā)酵橘子酒香氣成分，所得結(jié)果差異比較明顯，共同檢出的物質(zhì)有乙酸異戊酯、苯甲酸乙酯、辛酸乙酯、乙酸苯乙酯、9-癸烯酸乙酯、癸酸乙酯、月桂酸乙酯、苯乙醇、月桂烯、D-檸檬烯、萜品烯、3-蒈烯、(+)-樅油烯、波斯菊萜、巴倫西亞橘烯、4-乙烯基-2-甲氧基苯酚。但這些共有的香氣物質(zhì)中，各種物質(zhì)在5種酒中的含量差別比較大，普遍存在1.2～3倍的差距，有的甚至存在9～10倍的差距。乙酸異戊酯、己酸乙酯、辛酸乙酯、癸酸乙酯也在Kozan柑橘果酒中檢出[4]。這些新生成的酯類物質(zhì)是酵母在發(fā)酵過程中的初級(jí)代謝產(chǎn)物。在目前的報(bào)道中，有很多生香酵母可以產(chǎn)生苯乙醇。在高健等[5]分離的萵苣內(nèi)生香酵母GC-MS檢測(cè)中苯乙醇相對(duì)含量為5.21%，廖永紅等[6]分離的產(chǎn)香酵母中苯乙醇相對(duì)含量更低,僅為3.49%，而付俊淑等[7]分離出的酵母菌產(chǎn)苯乙醇相對(duì)含量較高，為19.03%。苯乙醇是一種比較典型的芳香醇[8]，閾值較低，僅為10 mg/L，具有淡雅細(xì)膩的玫瑰香氣，它也被認(rèn)為是Kozan柑橘果酒的特征香氣活性物質(zhì)[4]。因此，本次篩選出的JZ-1和JZ-2酵母具備產(chǎn)大量苯乙醇的優(yōu)勢(shì)功能。D-檸檬烯有一種較弱的柑橘香味,當(dāng)其含量低于190 ppm時(shí)，就是柑橘中的重要特征香氣物質(zhì)[9-10]。D-檸檬烯具有令人愉快的檸檬香氣[11]。巴倫西亞橘烯是橙汁和橙皮中一種重要的倍半菇類物質(zhì),并被用做橙汁的質(zhì)量指標(biāo)。但Elston等[12]研究發(fā)現(xiàn)，巴倫西亞橘烯可以作為柑橘成熟度的判定指標(biāo),但對(duì)柑橘的整體香氣沒有任何貢獻(xiàn)。1-戊醇、L-香芹醇、g-芹子烯、壬醛、2-乙氧基噻唑只在安琪果酒酵母發(fā)酵橘子酒中有檢出；甲酸異戊酯只在FX 10酵母發(fā)酵橘子酒中有檢出；α-金合歡烯、d-杜松烯只在高溫釀酒酵母發(fā)酵橘子酒中有檢出；α-水芹烯只在JZ-1酵母發(fā)酵橘子酒中有檢出。當(dāng)1-戊醇、L-香芹醇、1-辛醇這些高級(jí)醇類物質(zhì)的濃度低于300 mg/L時(shí)，就會(huì)產(chǎn)生令人愉悅的香氣[13]，這些醇類物質(zhì)也是酵母在發(fā)酵過程中的初級(jí)代謝產(chǎn)物。α-蒎烯也是柑橘的特征香氣物質(zhì)，除了JZ-1酵母釀造的酒中沒有檢出外，其他酒都有檢出。Selli等[4]曾指出乙酸乙酯也是柑橘果酒的特征香氣物質(zhì)，在安琪果酒酵母、JZ-1、JZ-2酵母釀造的酒中有檢出。

這說明經(jīng)過發(fā)酵釀造，5種酵母釀造的果酒都擁有柑橘果酒主體的特征香氣組分(16種物質(zhì)共有)，但也有各自獨(dú)有的香氣組分，存在特異性差異。從香氣成分種類數(shù)量來看，安琪果酒酵母發(fā)酵橘子酒中檢出最多，有32種，果酒香氣成分最豐富。以柑橘果酒的特征香氣活性物質(zhì)苯乙醇和乙酸乙酯相對(duì)含量為根據(jù)，高溫釀酒酵母釀造的橘子酒中苯乙醇相對(duì)含量最高，但不含乙酸乙酯；JZ-2釀造的橘子酒中苯乙醇含量較高，乙酸乙酯相對(duì)含量也是最高的，生香效果最好。

3 結(jié)論

對(duì)篩選出的2種野生酵母與3種商業(yè)酵母所釀橘子酒香氣成分進(jìn)行比較，5種酵母釀造的果酒的香氣成分共檢出38種。5種酵母菌釀造的柑橘果酒中香氣組分的主體成分接近，都有乙酸異戊酯、苯甲酸乙酯、辛酸乙酯等16種物質(zhì)，但是各酵母菌種所釀果酒存在特有的香氣成分，1-戊醇、L-香芹醇、1-辛醇這些高級(jí)醇類物質(zhì)主要在安琪果酒酵母釀造的柑橘果酒中存在，g-芹子烯、壬醛、2-乙氧基噻唑只在安琪果酒酵母發(fā)酵橘子酒中有檢出；甲酸異戊酯只在FX 10酵母發(fā)酵橘子酒中有檢出；α-金合歡烯、d-杜松烯只在高溫釀酒酵母發(fā)酵橘子酒中有檢出；α-水芹烯只在JZ-1酵母發(fā)酵橘子酒中有檢出。安琪果酒酵母發(fā)酵橘子酒中檢出的香氣種類數(shù)最多，有32種。高溫釀酒酵母釀造的橘子酒中苯乙醇相對(duì)含量最高，JZ-2釀造的橘子酒中苯乙醇含量較高，乙酸乙酯相對(duì)含量也是最高的?？傊?，野生酵母JZ-2生香效果最好，安琪果酒酵母釀造的橘子酒，香氣成分最豐富。5種酵母釀造的果酒有共同的果酒特征香氣物質(zhì)，香氣組分又有特異性差異，基于各香氣成分的閾值不同，各成分對(duì)主體香氣的貢獻(xiàn)率也不同，不同酵母對(duì)釀造香氣主體的影響，有待于進(jìn)一步深入研究，通過GC-MS結(jié)合GC-O進(jìn)行嗅辨分析評(píng)價(jià)各香氣組分的差異對(duì)主體香氣的影響，將有助于對(duì)該問題的深入探討。

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