汪裕強

（黔南州食品藥品檢驗所，貴州都勻 558000）

普魯蘭酶能夠專一性切開α-1，6糖苷鍵并形成直鏈淀粉[1-2]，該酶符合聯合國糧農組織和世界衛(wèi)生組織要求的食品級酶制[3]，但普魯蘭酶在食品加工方面的應用甚少。經研究發(fā)現，普魯蘭酶能夠增加啤酒中的風味物質和提高發(fā)酵度[4-5]，而啤酒酵母與啤酒發(fā)酵密切相關[6-9]。

本文通過添加0、60、90、120 U/kg普魯蘭酶，觀察啤酒酵母菌落形態(tài)和生長曲線，研究普魯蘭酶對啤酒酵母的影響，希望為普魯蘭酶作用的開發(fā)和提高啤酒酵母的利用率提供理論依據。

1 材料與方法

1.1 材料

普魯蘭酶（酶活力為1 000 U/mL，最適pH 4.5～5.5，最適溫度55～60℃）、安琪啤酒干酵母、酵母膏、瓊脂、二棱大麥。

1.2 儀器與設備

超凈工作臺、721分光光度計、水浴恒溫振蕩器、微生物培養(yǎng)箱、可調式移液器、接種環(huán)、高壓滅菌鍋。

1.3 方法

1.3.1 制備麥芽汁固體培養(yǎng)基

大麥經制麥、發(fā)芽等過程獲得麥芽，粉碎麥芽，加水于60℃糖化2～3 h，攪拌至糖化完全，糖化液經12層紗布過濾后獲得麥芽汁。取1 000mL錐形瓶，加入麥芽汁800mL、瓊脂16 g、酵母膏72 g，用棉花封瓶，置于滅菌鍋滅菌1.05 kg/cm2，20 min；在培養(yǎng)基滅菌后倒平板25mL且未凝固前添加不同濃度的普魯蘭酶，混勻備用。制作麥芽汁斜面培養(yǎng)基：取15mm×150mm試管，加入4mL麥芽汁，用棉花封好試管口，用報紙包裹好置于滅菌鍋滅菌1.05 kg/cm2，20 min。

1.3.2 觀察啤酒酵母菌落

將啤酒酵母活化后，從瓶子中接種到10mL麥芽汁斜面培養(yǎng)基中復壯最少4支，于25℃培養(yǎng)25 h。按照無菌操作從4支斜面培養(yǎng)基中選出生長良好的進行斜面劃線3個，于25℃培養(yǎng)48 h。按照無菌操作挑選健壯、飽滿的4～5個啤酒酵母分別接種到添加不同濃度普魯蘭酶的麥芽培養(yǎng)基上于25℃培養(yǎng)。分別于4 d后和11 d后，在麥芽汁培養(yǎng)基上觀察啤酒酵母菌落。

1.3.3 測定啤酒酵母的生長曲線

麥芽汁液體培養(yǎng)基配制：取1 000mL錐形瓶，加入麥芽汁800mL、酵母膏72 g，用棉花封瓶，置于滅菌鍋滅菌1.05 kg/cm2，20 min。用接種環(huán)從斜面培養(yǎng)基上挑取1環(huán)菌；接種于10mL麥芽汁液體培養(yǎng)基，于25℃恒溫培養(yǎng)48 h，作為種子液。取種子液10mL接種于100mL麥芽汁液體培養(yǎng)基，在28℃恒溫200 r/min振蕩培養(yǎng)20 h，此時培養(yǎng)液渾濁。將721型分光光度計波長調整至560 nm，預熱30 min。取盛有90mL無菌麥芽汁液體培養(yǎng)基的250mL錐形瓶5個，各加入振蕩培養(yǎng)20 h的酵母培養(yǎng)液10mL，于25℃下恒溫振蕩培養(yǎng)，培養(yǎng)6 h后每瓶分別加入0、6、9、12 μL普魯蘭酶。于0、4、8、12、16、20、24、28、32 h和36 h分別用無菌移液管從各瓶吸取培養(yǎng)液2mL，經過一系列梯度稀釋后，以未接種的麥芽汁液體培養(yǎng)基校正比色計的零點，在光密度為560 nm條件下測定吸光值（A）記錄于表格中，每個吸光值測3次（n=3），以時間（h）為橫坐標，吸光值（A560）×稀釋倍數為縱坐標繪制成酵母生長曲線[8-10]。

1.3.4 數據分析

利用DPS數據處理系統(tǒng)對實驗數據進行F檢驗。

2 結果與分析

2.1 普魯蘭酶對啤酒酵母菌落的影響

將啤酒酵母通過無菌操作培養(yǎng)在添加4種不同濃度（0、60、90、120 U/kg）普魯蘭酶的麥芽培養(yǎng)基上，于4 d后觀察啤酒酵母菌落的形態(tài)，如圖1A～1D所示；于11 d后觀察啤酒酵母菌落的形態(tài)，如圖2A～2D。

圖1 添加普魯蘭酶4 d后啤酒酵母的菌落形態(tài)

在添加普魯蘭酶4 d后，啤酒酵母都在麥芽培養(yǎng)基上出現明顯的白色菌落（圖1），此時經4種不同普魯蘭酶濃度處理的啤酒酵母菌落顏色都很暗，菌落呈現的差異不明顯。

圖2 添加普魯蘭酶11 d后啤酒酵母的菌落形態(tài)

添加普魯蘭酶11 d后），啤酒酵母在麥芽汁培養(yǎng)基上都形成差異明顯的乳白色菌落。在普魯蘭酶的添加量為0 U/kg的條件下（圖2A），啤酒酵母的菌落小且不飽滿，表明啤酒酵母在未添加普魯蘭酶的條件下，生長緩慢不夠發(fā)達。在普魯蘭酶的添加量為60 U/kg的條件下（圖2B），啤酒酵母的生長得到促進，菌落比未添加普魯蘭酶的大、飽滿且有光澤。啤酒酵母在普魯蘭酶的添加量為90 U/kg的條件下（圖2C），較添加60 U/kg普魯蘭酶而言，體積、飽滿程度相差不大。當普魯蘭酶的添加量為120 U/kg時（圖2D），啤酒酵母的生長狀況有明顯的促進作用，菌落顏色呈乳白色、有光澤、最飽滿，且生長旺盛的孢子散落在其他未點樣的地方。結合啤酒酵母在麥芽培養(yǎng)基的生長狀況（圖1和圖2)，隨著普魯蘭酶添加量的增多和時間的推移，啤酒酵母在麥芽汁培養(yǎng)基的生長狀況出現了明顯的變化，對啤酒酵母生長的促進作用隨著普魯蘭酶濃度的升高而增加。這系由于在啤酒酵母代謝過程中，普魯蘭酶將麥芽汁中的使α-1，6糖苷鍵脫支，促進糖化分解，且普魯蘭酶本身無毒無害，不會對啤酒酵母產生質的變化，則啤酒酵母能充分利用培養(yǎng)基中的單糖以補充自身生長所需的碳源，充足的酵母膏為啤酒酵母提供生長所需的氮源，因而啤酒酵母在添加普魯蘭酶的培養(yǎng)基上形成的菌落更大更飽滿。綜上所述，普魯蘭酶對啤酒酵母的生長有良好的促進作用。

2.2 普魯蘭酶對啤酒酵母生長的影響

將啤酒酵母培養(yǎng)在添加4種不同普魯蘭酶濃度的麥芽汁液體培養(yǎng)基中，于0、4、8、12、16、20、24、28、32 h和36 h分別用無菌移液管從各瓶吸取培養(yǎng)液2mL，經過一系列梯度稀釋后，以未接種的麥芽汁液體培養(yǎng)基校正比色計的零點，利用DPS數據處理系統(tǒng)，在光密度為560 nm的條件下測定吸光值，見表1，每個吸光值測3次（n=3），并進行方差分析（表2）。最后以時間（h）為橫坐標，吸光值（A560）×稀釋倍數為縱坐標制作出四條酵母生長曲線，如圖3所示。

根據方差分析表（表2）可知，時間處理的F值為28.592 6，普魯蘭酶濃度處理的F值為2 171.846 6，則普魯蘭酶的影響效果更為顯著，且P值均小于0.001，因此本研究的結果有極顯著差異。本研究的誤差項很小，說明本研究的精確度高。

圖3 不同普魯蘭酶濃度下啤酒酵母的生長曲線

表1 添加四種濃度普魯蘭酶后啤酒酵母在不同時間培養(yǎng)液的吸光度（±S）

表1 添加四種濃度普魯蘭酶后啤酒酵母在不同時間培養(yǎng)液的吸光度（±S）

注：1.吸光度為3次重復的平均值±標準差；2.同列數字旁星號表示有顯著差異（*表示P＜0.05，**表示P＜0.01)。

時間/h 0 U/kg 60 U/kg 90 U/kg 120 U/kg 稀釋倍數0 0.038±0.002** 0.038±0.002** 0.039±0.003** 0.039±0.003** 14 0.069±0.005** 0.072±0.006** 0.073±0.005** 0.076±0.007** 18 0.177±0.011** 0.193±0.013** 0.199±0.014** 0.230±0.016** 1 12 1.189±0.037** 1.242±0.044** 1.254±0.050** 1.277±0.054** 5 16 3.101±0.111** 3.332±0.126** 3.512±0.123** 3.700±0.134** 10 20 4.105±0.160** 4.425±0.183** 4.618±0.177** 4.825±0.189** 15 24 7.420±0.211** 7.742±0.236** 7.910±0.242** 8.218±0.257* 20 28 8.510±0.295* 8.850±0.308* 9.112±0.312* 9.324±0.318* 30 32 8.815±0.283** 9.170±0.309* 9.398±0.312* 9.582±0.334* 30 36 3.876±0.165** 4.127±0.161** 4.295±0.169** 4.581±0.177** 20 40 2.586±0.138** 2.858±0.163** 2.994±0.151** 3.210±0.174** 15 44 2.546±0.160** 2.799±0.167** 2.920±0.142** 3.101±0.168** 10 48 2.579±0.173** 2.829±0.177** 2.952±0.182** 3.123±0.198** 10

表2 方差分析表

本研究采用比濁計數法，經一系列梯度稀釋后，根據測定的吸光值（表1）繪制成4條生長曲線（圖3），啤酒酵母在不同普魯蘭酶濃度處理下均出現了4個階段：啤酒酵母的生長在0～8 h為遲緩期，8～24 h為指數期，24～36 h為穩(wěn)定期，36 h后進入衰亡期，這也是4條生長曲線的共性，在30 h時生長最為旺盛，菌株活力很強，吸光值×稀釋倍數達到9以上，十分適合菌種采樣，生長曲線反映了啤酒酵母在培養(yǎng)繁殖過程中的生長規(guī)律，則普魯蘭酶不會對酵母細胞的生長周期產生影響。但從縱向觀察四條生長曲線，當加入不同濃度的普魯蘭酶后，吸光值A（代表樣品菌液濃度）隨著普魯蘭酶濃度的升高而增加，根據朗伯比爾定律（A=Kbc），在摩爾吸光吸收系數K與吸收層厚度b不變的條件下，吸光度A只與物質的濃度c有關，因此經4種濃度處理后的啤酒酵母在液體培養(yǎng)基中的吸光值（A560）與細菌懸濁液成正比關系，通過分光光度計測量后就掌握了酵母細胞的濃度變化。當添加普魯蘭酶濃度為60 U/kg時，R2（決定系數）=0.183 3。當添加普魯蘭酶濃度為60 U/kg時，酵母細胞濃度從指數期開始比添加0 U/kg普魯蘭酶時高，增幅較大，R2=0.196 9。當添加普魯蘭酶濃度為90 U/kg時，酵母細胞濃度從指數期開始比添加60 U/kg普魯蘭酶時高，增幅較小，兩條曲線之間的間隙也較小，R2=0.201 6。當添加普魯蘭酶濃度為120 U/kg時，酵母細胞濃度從指數期開始比添加90 U/kg普魯蘭酶時高，而增幅非常小，R2=0.212 1。由于四條酵母生長曲線R2都趨近于0，因此吸光度A與時間的線性關系很小。

由于在啤酒酵母代謝過程中，普魯蘭酶將麥芽汁中的使α-1，6糖苷鍵脫支，促進糖化分解，且普魯蘭酶本身無毒無害，啤酒酵母能充分利用培養(yǎng)基中的單糖以補充自身生長所需的碳源，充足的酵母膏為啤酒酵母提供生長所需的氮源。啤酒酵母在添加普魯蘭酶的液體培養(yǎng)基中細胞分化就很旺盛，酵母細胞濃度也就高，表明普魯蘭酶對啤酒酵母的生長有良好地促進作用，確保后續(xù)能夠在發(fā)酵時添加普魯蘭酶的條件下進行良好地生長代謝。

3 結論

本研究在麥芽汁培養(yǎng)基中添加（0～120 U/kg）普魯蘭酶，普魯蘭酶使麥芽汁中的使α-1，6糖苷鍵脫支，促進糖化分解，經過觀察啤酒酵母菌落形態(tài)和生長曲線，當添加普魯蘭酶濃度為120 U/kg時，酵母細胞濃度最高。這是由于普魯蘭酶本身無毒無害，啤酒酵母能充分利用培養(yǎng)基中的單糖以補充自身生長所需的碳源，充足的酵母膏為啤酒酵母提供生長所需的氮源，有利于其對糖類物質的利用，促進啤酒酵母產生更多的酒精和CO2。該結果不僅具有重要的理論意義，擴寬普魯蘭酶的應用領域，還能提高啤酒酵母的利用率，對強化食品發(fā)酵及風味改善有積極作用。

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