王麗鳴 于秀華

分泌性中耳炎目前被定義為“不伴有耳部急性感染癥狀和體征的中耳積液”，以耳痛、耳內(nèi)悶脹感或堵塞感、聽(tīng)力減退及耳鳴為最常見(jiàn)癥狀[1]。小兒分泌性中耳炎發(fā)病率有逐年增高的趨勢(shì)，也是兒童最常見(jiàn)的致聾原因，僅次于藥物性聾。因此開(kāi)發(fā)研究治療此類(lèi)病癥的制劑有社會(huì)意義。

1 儀器與材料

1.1 儀器

LC-2010A型高效液相色譜儀（日本島津），SPD-10AVP檢測(cè)器，C18柱（4.6 mm×250 mm，5 μm），Lambda25型紫外分光光度計(jì)（美國(guó)PE分析儀器廠），CP225D型雙量程電子分析天平（德國(guó) Sartoris），KQ-250DE型數(shù)控超聲波清洗器（昆山市超聲儀器有限公司）。

1.2 藥品

黃芩苷對(duì)照品（中國(guó)藥品生物制品檢定所）；甲醇為色譜純，水為超純水，其他試劑均為分析純。

2 方法與結(jié)果

2.1 吸水率測(cè)定

稱(chēng)取原處方量的藥材總重76 g，加入總量的4倍水，密封，每30 min測(cè)一次體積，3 h后吸水量不再增加，測(cè)得吸水量為128 ml，所以該處方吸水率為2倍。選擇加水量為藥材的4倍、6倍、8倍。

2.2 水煎提取工藝正交實(shí)驗(yàn)設(shè)計(jì)

對(duì)本處方的理化性質(zhì)、化學(xué)成分的研究分析后，制訂了該處方制劑中各藥材的提取方法，黃芩苷為其主要活性物質(zhì)之一，且該處方中的金銀花、黃芩、連翹等主要有效成分水溶性均很良好[2]，所以以水為提取溶劑，采用煎煮法進(jìn)行提取。按原處方比例稱(chēng)取金銀花、黃芩、連翹等 9 份，每份試驗(yàn)藥材總重76 g，黃芩精密稱(chēng)定，以加水量（A）、提取時(shí)間（B）和提取次數(shù)（C）為考察因素，采用三水平三因素L9（34）正交試驗(yàn)，以黃芩苷含量和干浸膏得率為評(píng)價(jià)指標(biāo)，通過(guò)正交試驗(yàn)法對(duì)金連利耳口服液的提取工藝進(jìn)行優(yōu)選。因素水平表見(jiàn)表1，正交試驗(yàn)結(jié)果見(jiàn)表2。方差分析結(jié)果見(jiàn)表3。

2.3 黃芩苷含量測(cè)定

2.3.1 色譜條件與系統(tǒng)適應(yīng)性試驗(yàn)[3-4]色譜柱：以十八烷基硅烷鍵合硅膠為填充劑；流動(dòng)相：甲醇-水-磷酸 -（45∶55∶0.2）；檢測(cè)波長(zhǎng)：280 nm；柱溫：室溫。

應(yīng)用預(yù)選的實(shí)驗(yàn)條件對(duì)供試品溶液、對(duì)照品溶液、陰性對(duì)照溶液進(jìn)行測(cè)定，其理論塔板數(shù)、分離度、保留時(shí)間、拖尾因子均符合要求，表明此色譜條件可行。

2.3.2 對(duì)照品溶液的制備 取黃芩苷對(duì)照品適量，精密稱(chēng)定，加甲醇溶解制成0.1 mg/ml 的溶液，作為對(duì)照品溶液。

2.3.3 線性關(guān)系考察 分別精密吸取對(duì)照品溶液2.0、4.0、8.0、10.0、12.0、15.0、20.0 μl，注入液相色譜儀，測(cè)定，以峰面積積分值（Y）為縱坐標(biāo)，以對(duì)照品（X）進(jìn)樣量為橫坐標(biāo)，繪制標(biāo)準(zhǔn)曲線及回歸方程。

表1 金連利耳口服液水溶性成分提取工藝因素水平表

表2 水提L9（34）正交試驗(yàn)表

表3 黃芩苷含量方差分析結(jié)果

2.3.4 供試品溶液制備 取1～9號(hào)樣品各適量，精密稱(chēng)定，精密加入70%乙醇30 ml，稱(chēng)重，超聲處理（功率250 W，頻率40 kHz）30 min，稱(chēng)重，用70%乙醇補(bǔ)足減失的重量，搖勻，濾過(guò)，取續(xù)濾液作為供試品溶液。

2.3.5 樣品測(cè)定 按照2.3.1條件測(cè)定樣品。

2.3.6 統(tǒng)計(jì)方法 試驗(yàn)中全部的數(shù)據(jù)均應(yīng)用SPSS 19.0統(tǒng)計(jì)軟件進(jìn)行分析處理。采用方差分析，P為雙側(cè)檢驗(yàn)，P＜0.05為差異具有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義；P＜0.01 為差異具有顯著統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。

2.4 水煎提取工藝結(jié)果

根據(jù)正交實(shí)驗(yàn)表及黃芩苷含量的方差分析表可知，提取次數(shù)（C）對(duì)處方中的黃芩苷含量影響最為顯著，加水量（A）影響次之，提取時(shí)間（B）影響最小，優(yōu)水平為C＞A＞B，且C3＞C2＞ C1，B3＞ B1＞ B2，A2＞ A3＞ A1優(yōu)組合為 C3＞ A2＞ B3。所以該實(shí)驗(yàn)選擇的組合為C3A2B2，即提取次數(shù)為3次，加水量為6倍，煎煮時(shí)間為1.5 h。

2.5 醇沉濃度的選擇

取原處方量按照最佳加水煎煮，濾液濃縮至1.10～1.15（80℃），取等量三份，分別加乙醇使最終濃度為60%、70%、80%，放置（4℃）24 h，濾過(guò)，濾液回收乙醇至無(wú)醇味，蒸干，減壓真空干燥，測(cè)出膏率。測(cè)得的三者的出膏率分別為7.74%、7.37%、5.58%。

分別取水煎處理液3份，精密稱(chēng)定，分別加乙醇40 ml至乙醇最終濃度為60%、70%、80%，稱(chēng)重，超聲處理30 min，放冷，稱(chēng)重，分別加60%、70%、80%濃度的乙醇補(bǔ)足減失的重量，搖勻，濾過(guò)，濾液置100 ml量瓶中，分別用少量60%、70%、80%濃度的乙醇分次洗滌所用容器和殘?jiān)?，洗液濾入同一容量瓶中，分別加60%、70%、80%濃度的乙醇定容至刻度，搖勻，濾過(guò)，即得。結(jié)果測(cè)得的黃芩苷的量分別為44.42 mg/g、39.78 mg/g、40.20 mg/g。

結(jié)果：以60%乙醇為提取溶劑所得樣品出膏率最多，且黃芩苷含量最高，因此選用60%乙醇為最終溶液含醇量。

3 討論

黃芩歸肺、膽、脾、大腸、小腸經(jīng)。通過(guò)現(xiàn)代的研究結(jié)果得知，黃芩當(dāng)中是以黃酮類(lèi)化合物為主要的活性成分，而且中黃芩苷的含量最高且其藥理作用最為明顯[5-7]。相關(guān)實(shí)驗(yàn)表明，黃芩總黃酮可以明顯將小鼠強(qiáng)迫游泳以及懸尾實(shí)驗(yàn)所需花費(fèi)的時(shí)間縮短，因此，其具有潛在的抗抑郁的效果[8]。

[1] 徐曉霞，周美萍，張小英. 疏風(fēng)解毒膠囊治療小兒急性非化膿性中耳炎臨床觀察[J]. 中華中醫(yī)藥雜志，2017，32（1）：368-370.

[2] 魯寅生，梁艷. RP－HPLC法測(cè)定小兒柴桂退熱顆粒中芍藥苷和黃芩苷的含量[J]. 西北藥學(xué)雜志，2017，32（5）：313-315.

[3] 張德靜，牛小彩. 復(fù)方地黃合劑及復(fù)方逍遙合劑中黃芩苷含量測(cè)定[J]. 上海醫(yī)藥，2017，38（5）：66-69.

[4] 韋瑀龍，藍(lán)曉慶，黃敏，等. 復(fù)方感冒顆粒特征圖譜與黃芩苷含量測(cè)定方法研究[J]. 西部中醫(yī)藥，2017，30（3）：27-31.

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[8] 栗俞程，李寒冰，張賓. 黃芩總黃酮對(duì)小鼠的抗抑郁作用[J]. 中國(guó)實(shí)驗(yàn)方劑學(xué)雜志，2011，17（23）：168-170.