王 偉,楊曉君,高 蕾,戴小華,陳 愷

(新疆農(nóng)業(yè)大學(xué)食品科學(xué)與藥學(xué)學(xué)院,新疆烏魯木齊 830052)

近年來(lái),研究表明植物源多糖是一類非常重要的生物活性物質(zhì),在經(jīng)濟(jì)領(lǐng)域與臨床應(yīng)用上逐漸引起越來(lái)越多的關(guān)注[1]。蕪菁(BrassicarapaL.),屬于十字花科(Cruciferae)蕓苔屬(Brassica)草本植物,被維吾爾族用來(lái)治療咳嗽和支氣管哮喘[2]。據(jù)報(bào)道,蕓苔屬植物含有芥子油甙、花青素、多糖、萜烯及香豆素類等生物活性物質(zhì),這些生物活性物質(zhì)與阻止氧化應(yīng)急、免疫調(diào)節(jié)、減少癌癥發(fā)生率等功效有關(guān)[3]。

Xie等[4]研究表明中國(guó)青海省及西藏自治區(qū)的蕪菁多糖具有抗缺氧的功效;Jafarian-Dehkordi等[5]發(fā)現(xiàn)不同有機(jī)溶劑的蕪菁提取液均對(duì)小鼠具有免疫調(diào)節(jié)作用。但目前對(duì)新疆蕪菁多糖生物活性的研究還未見(jiàn)報(bào)道。因此,本論文主要對(duì)新疆蕪菁多糖的提取工藝進(jìn)行優(yōu)化,并利用DPPH自由基清除能力和還原力評(píng)價(jià)其體外抗氧化能力,為今后新疆蕪菁的開(kāi)發(fā)利用奠定一定的理論基礎(chǔ)。

1 材料與方法

1.1 材料與儀器

新疆蕪菁 新疆烏魯木齊市農(nóng)貿(mào)市場(chǎng);DPPH、VC美國(guó)Sigma公司;苯酚、濃硫酸、乙醇、乙醚、丙酮、氯化鐵及三氯乙酸等均為國(guó)產(chǎn)分析純。

HH-6數(shù)顯恒溫水浴鍋 常州普天儀器制造公司;TDZ5-WS臺(tái)式離心機(jī) 長(zhǎng)沙湘智離心機(jī)儀器有限公司;DHG-9140A恒溫鼓風(fēng)干燥箱 上海一恒科技有限公司;AY-120電子天平 日本SHIMADZU公司;SF180粉碎機(jī) 上海制藥儀器公司;OSB-2100真空旋轉(zhuǎn)蒸發(fā)儀 日本EYELA公司。

1.2 實(shí)驗(yàn)方法

1.2.1 蕪菁多糖(BRP)的提取工藝 原料預(yù)處理:將新疆蕪菁洗凈、切片,30 ℃烘干,粉碎后過(guò)60目篩,然后用80%乙醇浸提24 h,反復(fù)2～3次,料渣于30 ℃烘干,置于干燥皿中備用。

在一定料液比、溫度、時(shí)間和提取次數(shù)下進(jìn)行熱水浸提,浸提液抽濾取上清,50 ℃旋蒸濃縮至1/8原體積,向濃縮液加3倍體積無(wú)水乙醇后置于4 ℃冰箱過(guò)夜,3000 r/min 離心10 min取沉淀,依次用乙醚、無(wú)水乙醇和丙酮洗滌沉淀,20 ℃烘干至恒重,得到的即為蕪菁多糖,多糖得率按下式計(jì)算:

式中:W1為多糖質(zhì)量,g;W0為預(yù)處理后干燥蕪菁粉末質(zhì)量,g。

1.2.2 單因素實(shí)驗(yàn)設(shè)計(jì) 液料比分別設(shè)置為40、50、60、70和80 mL/g,其它提取條件分別為提取溫度90 ℃,提取時(shí)間2 h,提取次數(shù)1次;提取溫度分別設(shè)置為80、85、90、95和100 ℃,其它提取條件分別為提取時(shí)間2 h,液料比70 mL/g,提取次數(shù)1次;提取時(shí)間分別設(shè)置為1、2、3、4和5 h,其它提取條件分別為提取溫度95 ℃,液料比70 mL/g,提取次數(shù)1次;提取次數(shù)分別設(shè)置為1、2、3、4和5,其它提取條件分別為提取溫度95 ℃,液料比70 mL/g,提取時(shí)間4 h。

1.2.3 響應(yīng)面法(RSM)優(yōu)化提取工藝 根據(jù)單因素實(shí)驗(yàn)結(jié)果,選取提取溫度(X1)、液料比(X2)及提取時(shí)間(X3)三個(gè)實(shí)驗(yàn)因子,在適宜范圍內(nèi),采用響應(yīng)面法(RSM)的Box-Behnken design(BBD)優(yōu)化新疆蕪菁多糖的提取工藝,因素水平見(jiàn)表1。

表1 Box-Behnken設(shè)計(jì)各因素的編碼及實(shí)驗(yàn)水平Table 1 Code and level of factors chosen for Box-Behnken design

1.2.4 新疆蕪菁多糖的體外抗氧化活性研究

1.2.4.1 DPPH自由基清除能力的測(cè)定 DPPH自由基清除活性的測(cè)定參照?qǐng)?bào)道的方法并稍作修改[6]：依次移取濃度為0.25、0.5、0.75、1.0、2.0、3.0及4.0 mg/mL的多糖溶液1.0 mL,分別加入0.4 mmol/L DPPH溶液0.5 mL,加水2.0 mL,混勻,30 ℃暗處反應(yīng)30 min,于517 nm處測(cè)定吸光值。VC作為陽(yáng)性對(duì)照,利用下式計(jì)算DPPH自由基清除活性:

式中：A0是對(duì)照的吸光值(即以水代替樣品),A1是樣品的吸光值,A2是樣品自身干擾的吸光值(即以水替代DPPH溶液)。

1.2.4.2 還原能力的測(cè)定 參照師萱[7]的方法并稍作修改。在2.0 mL樣品中加入0.2 mol/L磷酸鹽緩沖液(pH=6.6)2.0 mL和K3Fe(CN)6溶液(1%,w/v)2.0 mL,混勻后50 ℃反應(yīng)20 min,再加2.0 mL三氯乙酸(10%,w/v),0.5 mL氯化鐵溶液(0.1%,w/v),測(cè)定700 nm吸光值。VC作為陽(yáng)性對(duì)照,按下式計(jì)算還原力:

還原力=A1-A2

式中：A1是樣品的吸光值,A2是樣品干擾的吸光值(即以水代替氯化鐵溶液)。

1.3 統(tǒng)計(jì)分析

所有數(shù)據(jù)均以平均值±標(biāo)準(zhǔn)差(Mean±SD)表示,使用SPSS 20.0統(tǒng)計(jì)軟件的單因素方差分析(One-way ANOVA)和Tukey檢驗(yàn)進(jìn)行顯著性分析,不同字母代表差異顯著(p<0.05)。

2 結(jié)果與分析

2.1 液料比對(duì)新疆蕪菁多糖得率的影響

液料比對(duì)新疆蕪菁多糖得率的影響如圖1所示。

圖1 液料比對(duì)新疆蕪菁多糖得率的影響Fig.1 Effect of ratio of extraction solvent to raw material on the extraction yield of BRP

由圖1可知:當(dāng)液料比從40 mL/g增加到70 mL/g時(shí),新疆蕪菁多糖得率由13.82%增加(p<0.05)到19.97%;之后,隨著液料比繼續(xù)增加,新疆蕪菁多糖得率開(kāi)始下降(p<0.05)。這種現(xiàn)象可能是由于液料比過(guò)小會(huì)導(dǎo)致多糖溶解不完全,而液料比過(guò)大會(huì)導(dǎo)致后續(xù)醇沉等工藝勞動(dòng)強(qiáng)度加大[8]。因此,為了避免提取溶劑和濃縮費(fèi)用的浪費(fèi),液料比為70 mL/g被選擇作為Box-Behnken design(BBD)實(shí)驗(yàn)的中心點(diǎn)。

2.2 提取溫度對(duì)新疆蕪菁多糖得率的影響

提取溫度對(duì)新疆蕪菁多糖得率的影響如圖2所示。

圖2 提取溫度對(duì)新疆蕪菁多糖得率的影響Fig.2 Effect of extraction temperature on the extraction yield of BRP

由圖2可知,當(dāng)提取溫度從80 ℃增加到95 ℃時(shí),新疆蕪菁多糖得率由10.37%增加(p<0.05)到17.68%;之后,隨著提取溫度繼續(xù)增加,新疆蕪菁多糖得率基本保持不變。原因可能是隨著提取溫度的升高,樣品溶液的粘度減小,溶劑可以更好的滲透到原料中,使溶劑溶解原料組分的能力提高[9];當(dāng)溫度升高至100 ℃時(shí),溶劑蒸發(fā)量和多糖濃度的增大反而不利于多糖的提取[10]。因此,選擇提取溫度95 ℃作為Box-Behnken design(BBD)實(shí)驗(yàn)的中心點(diǎn)。

2.3 提取時(shí)間對(duì)新疆蕪菁多糖得率的影響

提取時(shí)間對(duì)新疆蕪菁多糖得率的影響如圖3所示。

圖3 提取時(shí)間對(duì)新疆蕪菁多糖得率的影響Fig.3 Effect of extraction time on the extraction yield of BRP

由圖3可知:當(dāng)提取時(shí)間從1 h增加到4 h時(shí),新疆蕪菁多糖得率由12.26%增加(p<0.05)到20.02%;4 h之后,新疆蕪菁多糖得率基本保持不變。這種現(xiàn)象可能是隨著原料與提取溶劑接觸時(shí)間的延長(zhǎng),原料組分不斷從原料中擴(kuò)散出來(lái),但是當(dāng)大部分的原料組分都通過(guò)擴(kuò)散溶解到提取溶劑中后,繼續(xù)延長(zhǎng)提取時(shí)間,反而不利于多糖得率的提高[11]。因此,提取時(shí)間4 h被選擇作為Box-Behnken design(BBD)實(shí)驗(yàn)的中心點(diǎn)。

2.4 提取次數(shù)對(duì)新疆蕪菁多糖得率的影響

提取次數(shù)對(duì)新疆蕪菁多糖得率的影響如圖4所示。

圖4 提取次數(shù)對(duì)新疆蕪菁多糖得率的影響Fig.4 Effect of extraction times on the extraction yield of BRP

由圖4可知:當(dāng)提取次數(shù)從1次增加到3次時(shí),新疆蕪菁多糖得率由19.38%增加(p<0.05)到22.29%;之后,繼續(xù)增加提取次數(shù),新疆蕪菁多糖得率基本保持不變。另外考慮到新疆蕪菁多糖提取成本[12],選擇提取次數(shù)為3次。

2.5 響應(yīng)面法優(yōu)化新疆蕪菁多糖的提取工藝

根據(jù)單因素實(shí)驗(yàn)結(jié)果,分別選取液料比60～80 mL/g,提取溫度90～100 ℃,提取時(shí)間3～5 h進(jìn)行響應(yīng)面法(RSM)的Box-Behnken design(BBD)實(shí)驗(yàn)對(duì)新疆蕪菁多糖的提取工藝進(jìn)行優(yōu)化,實(shí)驗(yàn)結(jié)果見(jiàn)表2,新疆蕪菁多糖得率從17.32%到23.28%不等,利用Design-Expert(Version 8.0.7)軟件對(duì)實(shí)驗(yàn)結(jié)果進(jìn)行多元回歸分析,Y=7.1785X1+1.6985X2+9.6775X3+0.00305X1X2+0.0695X1X3-0.10275X2X3-0.03895X12-0.010388X22-1.06875X32-415.9375。式中,Y為新疆蕪菁多糖得率的預(yù)測(cè)值;X1、X2、X3分別代表提取溫度、液料比和提取時(shí)間的編碼值。

表2 新疆蕪菁多糖的Box-Behnken實(shí)驗(yàn)設(shè)計(jì)及其響應(yīng)值Table 2 Box-Behnken design and the response values for the yield of BRP

表3 多元回歸模型方差分析Table 3 ANOVA for quadratic polynomial model

注:*差異顯著(p<0.05),**差異較顯著(p<0.01),***差異極顯著(p<0.001)。

表4 響應(yīng)面回歸模型的方差分析Table 4 ANOVA for response surface quadratic model

注:*差異顯著(p<0.05),**差異較顯著(p<0.01),***差異極顯著(p<0.001)。 從表4中可以看出,二次項(xiàng)系數(shù)(X12,X22及X32),線性系數(shù)(X1,X2及X3),實(shí)驗(yàn)因子交互系數(shù)(X1X3及X2X3)都存在顯著差異(p<0.05),而其他實(shí)驗(yàn)因子交互系數(shù)(X1X2)不顯著。

在各實(shí)驗(yàn)因素的取值范圍內(nèi),利用Design-Expert(Version 8.0.7)軟件預(yù)測(cè)最優(yōu)的提取條件為:提取溫度93.18 ℃,液料比75.11 mL/g,提取時(shí)間4.3 h，多糖得率的預(yù)測(cè)值為23.89%±0.34%。為了便于新疆蕪菁多糖提取條件的實(shí)際操作,最優(yōu)的提取條件修正為:提取溫度93 ℃,液料比75 mL/g,提取時(shí)間4.3 h。在該最優(yōu)提取條件下進(jìn)行三次驗(yàn)證實(shí)驗(yàn),測(cè)得的新疆蕪菁多糖得率為23.72%±0.33%。

2.6 新疆蕪菁多糖的體外抗氧化活性研究

2.6.1 DPPH自由基清除能力的測(cè)定 DPPH自由基能夠接受一個(gè)氫原子變成穩(wěn)定的DPPH·H分子[13],因此,DPPH自由基被廣泛用于評(píng)價(jià)多糖的自由基清除能力。

由圖5可知,新疆蕪菁多糖的DPPH自由基清除能力具有量效依存關(guān)系,在該體系中的EC50值為8.55 mg/mL,多糖樣品的活性明顯低于VC(p<0.05),表明新疆蕪菁多糖具有中等的DPPH自由基清除活性。

圖5 新疆蕪菁多糖的DPPH自由基清除活性Fig.5 Scavenging activity on DPPH radical of BRP

2.6.2 還原能力的測(cè)定 多糖還原力是其抗氧化活性的重要指標(biāo),研究表明還原力與樣品的抗氧化活性緊密聯(lián)系[14],機(jī)理主要為樣品中的還原酮通過(guò)電子/氫原子給予能力,阻止自由基鏈形成,從而發(fā)揮抗氧化活性作用[15]。

由圖6可知,新疆蕪菁多糖的還原力具有量效依存關(guān)系,在該體系中的EC50值為2.25 mg/mL,表明新疆蕪菁多糖具有較強(qiáng)的還原力,然而,其還原力明顯低于VC(p<0.05)。

圖6 新疆蕪菁多糖的還原能力Fig.6 Reducing power of BRP

3 結(jié)論

本論文在單因素實(shí)驗(yàn)結(jié)果基礎(chǔ)上,采用響應(yīng)面法(RSM)對(duì)新疆蕪菁多糖的提取工藝進(jìn)行優(yōu)化,并利用DPPH自由基清除能力和還原力評(píng)價(jià)其體外抗氧化能力。利用Design-Expert(Version 8.0.7)軟件對(duì)實(shí)驗(yàn)結(jié)果進(jìn)行多元回歸分析,獲得的新疆蕪菁多糖二次多項(xiàng)回歸方程為:Y=7.1785X1+1.6985X2+9.6775X3+0.00305X1X2+0.0695X1X3-0.10275X2X3-0.03895X12-0.010388X22-1.06875X32-415.9375;最優(yōu)的新疆蕪菁多糖提取條件為:提取溫度93 ℃,液料比75 mL/g,提取時(shí)間4.3 h,提取次數(shù)3次,在該提取條件下進(jìn)行驗(yàn)證,測(cè)得的新疆蕪菁多糖得率為23.72%±0.33%。此外,體外抗氧化實(shí)驗(yàn)表明:新疆蕪菁多糖的DPPH自由基清除能力和還原力具有量效依存關(guān)系,其在兩種體系中的EC50值分別是8.55和2.25 mg/mL,表明新疆蕪菁多糖具有較強(qiáng)的體外抗氧化能力,可以作為天然抗氧化劑應(yīng)用于功能食品或者制藥工業(yè)。

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