陳 穎，彭鴻旭，李健欣，張鑫宇，李名珊，張秀麗

(東北林業(yè)大學(xué) 生命科學(xué)學(xué)院，黑龍江 哈爾濱 150040)

桑枝葉中含有18種氨基酸，其中動物必需和半必需氨基酸占總量的50%以上，尤其是谷氨酸、賴氨酸和蛋氨酸等在蛋白質(zhì)和糖代謝過程中起重要作用的幾種氨基酸含量較高，對動物體內(nèi)蛋白質(zhì)合成具有特別重要的意義[1]。與優(yōu)質(zhì)飼料苜蓿粉相比，桑枝葉粉粗蛋白含量高(10.6%)，碳水化合物含量高(32.1%)，纖維素含量低(50.0%)，粗脂肪低(12.5%)，灰分和總能量相當(dāng)，奶牛產(chǎn)奶能高(46.6%)，雞消化能高(15.8%)[2]。自2001年在杭州舉行的“利用桑葉資源發(fā)展畜牧業(yè)生產(chǎn)”國際會議的召開起，特別是在向仲懷院士多次提出“立桑為業(yè)，多元發(fā)展”后，“桑作飼料”“栽桑養(yǎng)畜”得到相關(guān)從業(yè)人員的廣泛關(guān)注[2]。桑樹做畜禽飼料不僅拓寬飼料來源，緩解人畜爭糧矛盾，而且彌補常規(guī)飼草夏季缺少青綠飼料之不足。同時桑葉中含有多種天然活性物質(zhì)，可提高畜禽抗逆力，改善畜禽產(chǎn)品風(fēng)味品質(zhì)。桑樹廣泛的生態(tài)適應(yīng)性和多年生、豐產(chǎn)、穩(wěn)產(chǎn)的特性更是使其備受關(guān)注。國家“東桑西移，南桑北移”工程及優(yōu)惠政策的實施，加快了北方干旱地區(qū)飼料桑開發(fā)利用[3]。

我國北方降雨在時空上分布不均，干旱頻繁給當(dāng)?shù)剞r(nóng)林業(yè)生產(chǎn)造成巨大損失[4]，干旱會直接導(dǎo)致植物根系吸水不足[5]，而葉片含水量下降引起氣孔關(guān)閉，輕者引起光抑制[6]，嚴重時直接導(dǎo)致植物的死亡。不同植物對于干旱的忍耐和適應(yīng)性不同，其對植物生長的影響取決于干旱的程度和持續(xù)的時間。以往，桑樹對干旱脅迫響應(yīng)的光合生理特性的研究，主要集中在土壤水分含量對飼料桑葉片的光合生理參數(shù)變化的影響，并發(fā)現(xiàn)最適合桑樹生長的土壤含水量(SWC)為45%～78%[7]。Guha等[8]報道，印度耐旱型桑樹品種V1(MorusindicaL.‘V1’)在SWC為(40±5)%的干旱脅迫下，桑樹葉片的PSⅡ的潛在最大光化學(xué)活性(Fv/Fm)值未發(fā)生變化[9]，但光系統(tǒng)Ⅱ的電子傳遞卻受到明顯的抑制。在生產(chǎn)實踐中，干旱發(fā)生時可能伴隨著強光或高溫[10]，而強光和高溫同樣會引起植物葉片PSⅡ活性降低和電子傳遞受阻；這種現(xiàn)象在以往的絕大多數(shù)相關(guān)研究論文中并未提及[9]，提及的論文中僅分析干旱和強光雙重脅迫共同導(dǎo)致光抑制的情況，并不能深入解釋干旱單一脅迫對于桑樹葉片光系統(tǒng)Ⅱ功能的影響。聚乙二醇(PEG)是一種親水性很強的大分子有機物，溶于水后能產(chǎn)生強大的滲透壓，因此聚乙二醇常用作植物耐旱性選擇劑或水分脅迫劑[11]。為排除強光和高溫等外界環(huán)境因子對干旱脅迫對飼料桑光系統(tǒng)Ⅱ研究的影響，采用不同濃度的PEG 6000模擬干旱，研究單一水分匱乏對飼料桑葉片光系統(tǒng)Ⅱ的具體影響。為此，本研究采用快速OJIP技術(shù)，可以快捷無損地檢測逆境下活體植物葉片光系統(tǒng)Ⅱ活性及電子傳遞情況研究不同程度的干旱脅迫，對飼料桑葉片的PSⅡ反應(yīng)中心吸收光能、光合電子傳遞及類囊體膜穩(wěn)定性和放氧復(fù)合體活性的影響機制，其結(jié)果可明確水分匱乏對于飼料桑葉片PSⅡ反應(yīng)中心活性、電子傳遞的抑制的具體位點，可為干旱地區(qū)飼料桑栽培提供基礎(chǔ)數(shù)據(jù)。

1 材料與方法

1.1 材料及處理

試驗于2016年8月在東北林業(yè)大學(xué)植物生理實驗室進行，供試飼料桑品種為1年生實生苗青龍桑，由黑龍江省蠶業(yè)研究所提供，苗高約0.5 m時進行試驗。將試驗材料放置在25/23 ℃(光∶暗)、光照強度500 lx、光周期14/10 h(光∶暗)、相對濕度75%條件下的光照培養(yǎng)箱中培養(yǎng)，避免受外界氣候因素的影響制約，專注探討干旱脅迫對飼料桑葉片PSⅡ功能的影響。

采用沙培法。每周澆2次不同濃度PEG 6000進行干旱脅迫處理，分別為清水對照CK、φw=0 MP(PEG濃度為0)，及輕度脅迫的φw=-0.24 MP(11.3%PEG)、φw=-0.79 MP(17.1%PEG)和φw=-1.27 MP(20%PEG)，每周澆1次營養(yǎng)液。

為防止各種營養(yǎng)礦質(zhì)鹽溶液發(fā)生化學(xué)反應(yīng)，根據(jù)化學(xué)性質(zhì)，將營養(yǎng)分成A、B、C、D四類母液備用，根據(jù)需要將各母液稀釋后混勻再用。其中，A為Ca(NO3)2·4H2O 116.00 g·L-1；B為EDTA2Na和FeSO4·7H2O，濃度分別為3.72和2.78 g·L-1；C為KNO3，KH2PO4和MgSO4·7H2O，濃度分別為50.60、13.60、49.39 g·L-1；D為H3BO3、MnSO4·H2O、ZnSO4·7H2O、CuSO4·5H2O、(NH4)6MO7O4·5H2O，濃度分別為2.86、1.69、0.12、0.02、0.08 g·L-1。其中，A、B、C液稀釋100倍，D液稀釋1 000倍。

1.2 葉綠素?zé)晒鈪?shù)的測定

利用Mini調(diào)制式掌上葉綠素?zé)晒鈨x(FluorPen FP 100 max，捷克)于2016年8月末對各組脅迫中長勢相對一致的5株幼苗(即5次重復(fù))進行測定。將飼料桑幼苗第3片完全展開葉(從上往下數(shù))進行30 min的暗適應(yīng)，然后測定葉片的葉綠素?zé)晒鈩恿W(xué)曲線，測定時儀器的打光位置避開葉片的主葉脈，約距離主葉脈2 cm，第3～4側(cè)葉脈之間。測量數(shù)據(jù)原初熒光(Fo)、最大熒光(Fm)、光系統(tǒng)II(PSⅡ)的最大光化學(xué)效率(Fv/Fm)和計算得到暗適應(yīng)后的PSⅡ的潛在活性(Fv/Fo)等。在OJIP曲線中測定中，誘導(dǎo)光強設(shè)為3 000 μmol·m-2·s-1的脈沖紅光，從10 μs開始記錄相對熒光強度(Fv)共記錄1 s，OJIP曲線上O、J、I和P點對應(yīng)的時刻分別為0.02、2、30和1 000 ms，利用平均值(重復(fù)3次)繪制OJIP曲線。O、L、K、J、I和P點的相對熒光強度分別以Fo、FL、FK、FJ、FI和FP表示，而L、K、J和I點的相對可變熒光分別以VL、VK、VJ和VI表示，OJIP曲線是按照Strasser等[12]的方法JIP-test進行分析。

為特異分析J點和I點可對可變熒光的變化，將OP曲線標準化，即將O點的相對熒光強度(Fo)設(shè)為0，而P點相對熒光強度(Fp)設(shè)為1，按公式(Ft-Fo)/(Fm-Fo)求得各時間點的相對可變熒光，其中Ft表示各時間點的相對熒光強度。

為進一步研究干旱脅迫對飼料桑幼苗葉片放氧復(fù)合體OEC活性和類囊體解離狀態(tài)的影響，即K和L點的相對可變熒光VL和VK變化，分別將OJ和OK曲線進行標準化，其計算公式分別為 (Ft-Fo)/(FJ-Fo)和(Ft-Fo)/(FK-Fo)，其中K和L點分別為OJIP曲線上0.3 ms和0.15 ms對應(yīng)的時刻分別計算PEG脅迫下處理標準化OP、OJ和OK曲線與CK之間的差值，分別以△VO-P、△VO-J、△VO-K表示。

1.3 數(shù)據(jù)處理和統(tǒng)計方法

運用Excel和DPS軟件對試驗數(shù)據(jù)進行統(tǒng)計分析，圖中數(shù)據(jù)為重復(fù)3次的平均值±標準差(SD)，采用單因素方差分析(One-way ANOVA)和最小顯著差異法(LSD)比較不同數(shù)據(jù)組間的差異。

2 結(jié)果與分析

2.1 PEG模擬干旱脅迫對OJIP曲線的影響

由圖1可以看出，隨著干旱脅迫程度的加強，飼料桑幼苗葉片失綠發(fā)黃，且葉片邊緣焦枯壞死程度加劇，尤其是下部的老葉，失綠面積依次增大甚至凋落。隨著干旱脅迫程度的增加，飼料桑幼苗的株高、鮮重、分枝數(shù)和葉片數(shù)均顯著低于CK(表1)。其中，水勢φw=-0.24 MP時，株高、鮮重和葉片數(shù)分別較CK低28.6%、75.0%和46.7%；相應(yīng)的φw=-0.79 MP的較CK低43.0%、77.9%和54.3%；φw=-1.27 MP的較CK低44.8%、78.0%和57.6%。

圖1 PEG模擬干旱對飼料桑幼苗植株形態(tài)的影響

處理株高/cm鮮重/g分枝數(shù)葉片數(shù)0(CK)75.9±7.63aA31.06±1.89aA3.1±1.224.38±6.58bB-0.2454.2±7.95bB7.72±1.04bB—13.33±3.12aA-0.7943.3±5.31cC6.85±0.70bB—11.14±2.21bAB-1.2741.9±0.07cC5.53±0.46cC—10.34±0.73cC

注：同列無相同大小寫字母分別表示不同處理間在0.01和0.05水平差異顯著。

2.2 PEG模擬干旱脅迫對桑樹葉片OJIP曲線的影響

重度干旱脅迫的PEG處理(φw=-0.79 MP和-1.27 MP)改變了飼料桑中葉片OJIP曲線形狀(圖2)。其中，O、J、I和P點的相對熒光強度(FO、FJ、FI和Fp)均顯著高于CK，輕度干旱脅迫處理(φw=-0.24 MP)的O點較CK高，而J和I點與CK差異不顯著，P點卻顯著低于CK。由標準化的OJIP曲線可清晰看到，隨著干旱脅迫程度的增加，J和I點的可變熒光分別在不同程度上高于CK。定量分析結(jié)果顯示，φw=-0.79 MP的干旱脅迫處理飼料桑葉片的FO、FJ、FI和Fp較CK分別高出66.0%、37.9%、15.0%和5.5%；φw=-1.27 MP的PEG脅迫的飼料桑葉片的FO、FJ、FI和Fp分別較CK高126.0%、64.8%、21.5%和8.6%。φw=-0.24 MP的PEG脅迫處理飼料桑葉片的的FO、FJ分別較CK高出20.0%和8.4%，而FI和Fp分別較CK低1.3%和4.7%。

2.3 干旱脅迫對飼料桑幼苗葉片標準化OJ和OK曲線的影響

PEG模擬干旱脅迫增加了飼料桑幼苗葉片L和K點的相對熒光強度(FL和FK)。φw=-0.24 MP的輕度干旱處理的飼料桑幼苗葉片的FL和FK較CK分別升高20.8%和17.1%，差異不顯著；φw=-0.79 MP處理的飼料桑幼苗葉片的FL和FK較對照分別升高69.1%和60.8%，差異極顯著；φw=-1.27 MP處理的飼料桑幼苗葉片的FL和FK較對照分別升高144.0%和116.0%，差異極其顯著。分別將OK和OJ曲線標準化(圖3)發(fā)現(xiàn)，標準化OK曲線上0.15 ms時，即L點的相對可變熒光(VL)與標準化OJ曲線上0.3 ms時即K點的相對可變熒光(VK)在脅迫程度間的變化情況與FL和FK趨勢相似。同時分別將干旱脅迫處理標準化OK和OJ曲線與CK標準化OK和OJ曲線作差值作圖可知，隨著水勢值的下降，ΔVL和ΔVK相應(yīng)增加，定量分析發(fā)現(xiàn)，水勢為φw=-0.24 MP、φw=-0.79 MP和φw=-1.27 MP處理的飼料桑幼苗葉片的VK分別較CK增加35.7%、88.6%和99.6%，VL分別較CK增加25.2%、64.5%和152.0%。

圖2 PEG模擬干旱脅迫對飼料桑幼苗葉片OJIP曲線的影響

2.4 PEG模擬干旱脅迫對飼料桑幼苗葉片PSII反應(yīng)中心活性及電子傳遞的影響

由圖3可以看出，隨著PEG模擬干旱脅迫程度的增加，光合系統(tǒng)性能指數(shù)(PIABS)值逐漸下降，φw=-0.24 MP、φw=-0.79 MP和φw=-1.27 MP處理的PIABS值較CK分別下降44.8%、73.8%和89.8%。而飼料桑葉片PSⅡ潛在活性(Fv/Fo)同樣隨著干旱脅迫強度的增加而下降，即φw=-0.24 MP、φw=-0.79 MP和φw=-1.27 MP處理的Fv/Fo值較CK的分別下降23.8%、44.0%和68.4%。各干旱脅迫處理飼料桑葉片的光系統(tǒng)Ⅱ(PSⅡ)潛在最大光化學(xué)效率(Fv/Fm=φP0)值均顯著低于CK，即φw=-0.24 MP、φw=-0.79 MP和φw=-1.27 MP處理的Fv/Fm值較CK的分別下降5.7%、12.4%和29.4%。而用于非光化學(xué)淬滅最大量子產(chǎn)額φD0隨著水勢下降而升高，φw=-0.24 MP、φw=-0.79 MP和φw=-1.27 MP處理較CK分別提高27.3%、58.5%和139.0%。而隨著干旱脅迫程度的增加，所吸收光能用于QA以后電子傳遞鏈的量子產(chǎn)額(φE0)逐漸降低，φw=-0.24 MP、φw=-0.79 MP和φw=-1.27 MP處理較CK分別低12.0%、25.8%和44.0%。

表示OJIP曲線J點(2 ms)關(guān)閉的反應(yīng)中心的數(shù)量或QA的還原量(VJ)和表示QA被還原的相對速率的相對可變熒光的初始斜率(Mo)，可用于分析逆境脅迫對飼料桑葉片PSⅡ電子傳遞鏈受體側(cè)氧化還原狀態(tài)的影響。本試驗結(jié)果表明，隨著干旱脅迫強度的增加，飼料桑葉片VJ和Mo的值隨之增大，即φw=-0.24 MP輕度脅迫處理的VJ和Mo值較CK升高12.5%和24.9%，與CK的差異不顯著。而重度干旱脅迫處理即φw=-0.79 MP和φw=-1.27 MP處理的VJ和Mo值較CK分別上升28.3%、39.5%和59.9%、96.5%。

PEG模擬干旱脅迫處理的飼料桑葉片PSⅡ反應(yīng)中心吸收的能量(ABS/RC)值和單位反應(yīng)中心熱耗散能量(DI0/RC)值均與CK差異顯著(圖4)。φw=-0.24 MP、φw=-0.79 MP和φw=-1.27 MP處理的ABS/RC值較CK分別下降30.2%、42.1%和50.8%，相應(yīng)各處理的DI0/RC值較CK分別下降56.3%、70.6%和80.7%。水勢為φw=-0.24 MP、φw=-0.79 MP干旱脅迫處理的飼料桑葉片單位反應(yīng)中心捕獲的用于電子傳遞的能量(ET0/RC)分別較CK升高4.2%和6.1%；而φw=-1.27 MP處理的ET0/RC較CK高8.9%。而與CK相比，干旱脅迫處理的飼料桑葉片單位反應(yīng)中心用于還原QA能量(TR0/RC)值均上升，其中φw=-0.24 MP、φw=-0.79 MP和φw=-1.27 MP處理分別較CK高10.8%、24.4%和40.3%；φw=-0.24 MP處理用于表示PQ庫容的VI值和用于表示PSⅡ捕獲能量從QA傳遞到QB的效率Ψo值較CK分別高出4.2%和6.8%，差異不顯著。φw=-0.79 MP和φw=-1.27 MP處理的VI值和Ψo值均顯著高出CK的7.9%、15.3%和7.9%、21.4%。

圖3 PEG模擬干旱脅迫對飼料桑幼苗葉片標準化OJ和OK曲線的影響

圖4 PEG模擬干旱對飼料桑葉片PSⅡ反應(yīng)中心活性和電子傳遞的影響

3 討論

葉綠素?zé)晒鈴姸扰c光化學(xué)反應(yīng)和熱耗散是相互競爭的一種關(guān)系，即可通過熒光產(chǎn)量的變化分析光化學(xué)效率和熱耗散變化的情況，因此熒光被認為是研究光能分配和光化學(xué)活性的探針[13]。光合作用過程的各個步驟均是密切偶聯(lián)，任何一步的變化都會影響到PSⅡ，從而引起熒光變化，特別是環(huán)境因子對植物光合過程的影響都可以通過葉綠素?zé)晒鈪?shù)反應(yīng)出來[14]。與光合氣體交換參數(shù)相比，葉綠素?zé)晒鈪?shù)被用于描述植物光合作用機理和光合生理狀況的變量或常數(shù)值，能夠反映植物光合作用“內(nèi)在性”的特點，被視為是研究植物光合作用與環(huán)境關(guān)系的內(nèi)在探針。植物對光能的吸收、傳遞和轉(zhuǎn)化一旦受到抑制，最主要的表現(xiàn)是光化學(xué)活性下降[15]。光合性能指數(shù)(PIABS)和潛在最大光化學(xué)效率(Fv/Fm=ΦPo)等熒光參數(shù)是研究植物光合生理狀態(tài)的重要指標，反映了植物葉片PSⅡ原初光能轉(zhuǎn)化效率[16]。本試驗中，隨著PEG模擬干旱脅迫強度的增加，飼料桑幼苗生長的表型特征表現(xiàn)出明顯的癥狀，相比CK，干旱脅迫處理的飼料桑葉片失綠發(fā)黃，葉片緣焦枯面積逐漸增大，株高降低，葉片數(shù)和葉面積均減少。重要的葉綠素?zé)晒鈪?shù)Fv/Fm值在低強度的干旱脅迫下與CK差異不顯著，在中度和重度干旱脅迫處理中，F(xiàn)v/Fm值顯著低于CK，這與以往試驗結(jié)果略有不同。前期研究發(fā)現(xiàn)，飼料桑葉片F(xiàn)v/Fm值對干旱不敏感[9,17]，并認為在干旱情況下，F(xiàn)O和Fm可能發(fā)生相同趨勢的變化，進而Fv/Fm值不變。為此，有人認為能反映反應(yīng)中心密度和電子在PSⅠ和PSⅡ之間的傳遞情況的PIABS，可從光能吸收、捕獲和電子傳遞3方面綜合反映光系統(tǒng)Ⅱ的活性[15]。同樣本試驗中，PIABS值均顯著低于CK，再次驗證PIABS敏感性大于Fv/Fm。

分析發(fā)現(xiàn)反應(yīng)中心吸收的能量(ABS/RC)值和單位反應(yīng)中心熱耗散能量(DI0/RC)隨著干旱脅迫強度的增加而逐漸下降，均顯著低于CK，而代表反應(yīng)中心捕獲的光能與用于熱耗散能量的比例的FV/FO，同樣隨著干旱脅迫程度的增加而下降。由雷達圖可以看出，DI0/RC下降的程度明顯大于ABS/RC的下降程度，說明將所捕獲的光能更多的用于反應(yīng)中心的熱耗散。而用于非光化學(xué)淬滅最大量子產(chǎn)額(φD0)隨著干旱脅迫程度的增加而顯著高于CK，進一步印證相應(yīng)的用于光化學(xué)反應(yīng)的能量可能下降。干旱脅迫的飼料桑葉片單位反應(yīng)中心捕獲的光能用于還原QA能量(TR0/RC)值卻顯著高于CK，而隨著干旱脅迫程度的增加所吸收光能用于QA以后，電子傳遞鏈的量子產(chǎn)額(φE0)卻逐漸降低，說明在受體側(cè)電子傳遞的抑制位點在QA以后。相應(yīng)的，在OJIP曲線上，VJ的增加可反映PSⅡ受體側(cè)QA向QB電子傳遞受阻的特異性標志[15]。輕度干旱脅迫處理下，表示關(guān)閉的反應(yīng)中心的數(shù)量或QA的還原量(VJ)和表示QA被還原的相對速率的相對可變熒光的初始斜率(Mo)與CK的差異不顯著。而中度和重度的干旱脅迫處理的VJ和Mo卻顯著低于CK，說明干旱脅迫導(dǎo)致PSⅡ受體側(cè)QA向QB電子傳遞受阻。OJIP曲線上I點(30 ms)的相對可變熒光VI的變化反映了電子由QA向QB傳遞過程中PQ庫的異質(zhì)性[12]。本試驗中，VI值增加表示PQ庫接受電子能力隨著干旱脅迫強度的增加而下降，但VI的增幅遠小于VJ的增加幅度。放氧復(fù)合體(OEC)是PSⅡ反應(yīng)中心氧化端最主要的結(jié)構(gòu)單元，OEC的破壞程度會抑制水裂解和電子傳遞[18]。用干旱脅迫處理標準化的OJIP曲線數(shù)值減去CK的差作圖后發(fā)現(xiàn)，出現(xiàn)VK值和VL值的增加意味著OEC受到傷害[19-20]，類囊體膜解離、其穩(wěn)定下降[21]，通過雷達圖觀察發(fā)現(xiàn)，VK值和VL值高出CK程度遠大于VJ和VI高出CK程度。PSⅡ電子傳遞過程受到抑制，可能會導(dǎo)致兩種結(jié)果：一是同化力NADPH被還原數(shù)量顯著減低，繼而光合同化物產(chǎn)物降低，固定的光能同樣下降，最終導(dǎo)致株高、生物量、分枝數(shù)和葉片數(shù)顯著下降；二是激發(fā)態(tài)的光子除了產(chǎn)生熒光以外，還可能以電子形式攻擊光合作用產(chǎn)生的氧氣，形成活性氧，破壞類囊體膜的穩(wěn)定性，當(dāng)OEC活性受到抑制時導(dǎo)致水裂解功能的紊亂，在葉綠體內(nèi)產(chǎn)生大量的H2O2，使葉綠體和類囊體的膜質(zhì)的氧化傷害加劇，膜透性增加[22]。而膜脂過氧化程度增加會使膜脂和膜蛋白游離出來形成一種脂質(zhì)體[23]，同樣馬英姿等[24]認為脂質(zhì)體的形成實質(zhì)是葉綠體類囊體降解聚集的結(jié)果。

4 小結(jié)

隨著干旱脅迫程度的增加，葉片的PSⅡ反應(yīng)中心的活性顯著下降。且受激發(fā)的過剩光量子抑制電子傳遞，且供體側(cè)的電子傳遞受到抑制的程度遠大于受體側(cè)電子傳遞的抑制程度，最終由飼料桑葉片光合能力下降導(dǎo)致幼苗株高、鮮重和分枝數(shù)及葉片數(shù)呈明顯下降趨勢。

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