李春楠，傅巧娟，趙?？?，孫 瑤

(杭州市農(nóng)業(yè)科學(xué)研究院 園藝研究所，浙江 杭州 310024)

蘭屬(Cymbidium)是觀賞蘭科(Orchidaceae)植物中具有重要觀賞價(jià)值的屬之一。國蘭主要是指蘭屬中的一部分地生種，包括春蘭(C.goeringii)、蕙蘭(C.faberi)、墨蘭(C.sinense)、建蘭(C.ensifolium)、寒蘭(C.kanran)、春劍(C.longibracteatum)、蓮瓣蘭(C.lianpan)等，姿態(tài)優(yōu)雅，韻味幽香，文化底蘊(yùn)深厚。大花蕙蘭(Cymbidiumhybridum)是以蘭屬中一些大花型附生種為親本通過多代人工雜交培育出的花色美艷、花朵碩大的一類優(yōu)良品種群。蘭屬植物不僅本身具有優(yōu)良的觀賞價(jià)值，也是蘭花品種改良的重要親本來源。

國蘭與大花蕙蘭的花粉是以花粉塊的形式存在于合蕊柱頂端藥帽之下，在顯微鏡下觀察多數(shù)由4個花粉細(xì)胞結(jié)合為四合體[1]。在蘭花雜交育種中，花粉活力的強(qiáng)弱直接決定了雜交授粉的成功率，影響授粉、受精乃至坐果整個過程，在遠(yuǎn)緣雜交中尤為重要。因此，明確親本的花粉特性和高活力時(shí)期有助于提高雜交坐果率，對蘭花雜交親本適宜授粉時(shí)間的選擇具有指導(dǎo)意義。前人已研究了大花蕙蘭、墨蘭、春蘭等部分品種開花當(dāng)天的花粉活性[2]、離體萌發(fā)條件[3-4]和花粉貯藏特性[2，5]，褚怡等[6]分析了大花蕙蘭和部分國蘭品種不同開花時(shí)間的花粉活力。本文以蘭屬常見栽培種(大花蕙蘭、春蘭、蕙蘭、墨蘭)各5個品種(材料)為試材，采用TTC(2，3，5-三苯基氯化四氮唑)染色法系統(tǒng)地分析種間不同花齡花粉的活力變化趨勢，為雜交親本選擇合適的授粉時(shí)間提供依據(jù)。

1 材料與方法

1.1 材料

試驗(yàn)材料為大花蕙蘭、春蘭、蕙蘭和墨蘭，各5個品種(材料)。大花蕙蘭品種包括九五至尊、KK560、101、712、887；春蘭品種包括色花、新月佩、集圓、汪字、雪山；蕙蘭品種(材料)包括金奧素、HL-1、HL-2、HL-3、HL-4；墨蘭品種包括吳字翠、金華山、幸姬、白墨、企黑。均栽植于杭州市農(nóng)業(yè)科學(xué)研究院連棟溫室中。

1.2 花粉采集方法

大花蕙蘭于開花前2 d(-2 d)至蕾期、花后3、8、13和18 d，分5次取花粉測定活力；春蘭、蕙蘭、墨蘭分別于開花前2 d(-2 d)至蕾期、花后1 d、4d、7 d和10 d，分5次取花粉測定活力。選擇晴天上午9:00～10:00采集蘭花花粉塊，去除藥帽，花粉塊用硫酸紙包好，帶回實(shí)驗(yàn)室測定活力。

1.3 花粉活力測定方法

TTC染色法。取新鮮花粉塊，搗碎成勻漿，加入0.5%TTC溶液，(25±2)℃條件下黑暗振蕩染色1～3 d。鏡檢時(shí)，取1～2滴染色液于載玻片上，蓋上蓋玻片，置于低倍顯微鏡下觀察。凡被染為紅色者為強(qiáng)活力花粉，淡紅色者為弱活力花粉，無色者為沒有活力或不育花粉。每處理重復(fù)3次，每重復(fù)觀察3個視野，每個視野至少統(tǒng)計(jì)100粒花粉。

花粉活力/%=染色花粉個數(shù)/花粉總數(shù)×100。

1.4 數(shù)據(jù)處理

在Excel中處理數(shù)據(jù)，利用DPS v7.05軟件中Duncan’s新復(fù)極差法進(jìn)行多重比較。

2 結(jié)果與分析

2.1 花齡對大花蕙蘭花粉活力的影響

在5個大花蕙蘭品種中，KK560在各開花時(shí)期的花粉活力都較高，呼吸作用強(qiáng)，相比之下，712則偏低。從圖1可見，花齡超過3 d，各品種花粉活力均呈下降趨勢，其中，KK560和887降速較緩，在整個測定時(shí)期持續(xù)高活力，花后18 d，有活力的花粉仍保持在60%以上?？傮w來看，花齡-2 d和3 d的花粉染色率較高，各品種均超過70%。

具有較強(qiáng)活力的花粉通常被TTC染成深紅色，

圖1 不同花齡大花蕙蘭TTC染色情況

而活力稍弱的花粉則被染為淡紅色。將大花蕙蘭強(qiáng)、弱花粉TTC染色情況區(qū)別比較發(fā)現(xiàn)(表1)，所有品種的強(qiáng)活力花粉染色率以花齡-2 d和3 d最高，與其余花齡相比差異達(dá)到極顯著水平；在花后8、13和18 d的活性表現(xiàn)出顯著下降的趨勢，與花粉活力總趨勢相應(yīng)；弱活力花粉染色率在5個品種間也呈現(xiàn)逐漸下降的趨勢，但大部分品種降幅不明顯(除101以外)，以KK560和九五至尊變化較小，表明大花蕙蘭在花齡-2 d和3 d時(shí)強(qiáng)活力花粉占比高，開花3 d后強(qiáng)活力花粉數(shù)量急劇減少，可能是引起整體花粉活力減弱的主要原因。

表1 不同花齡大花蕙蘭強(qiáng)、弱活力花粉染色率

注：同列無相同大、小寫字母者，分別表示組間差異達(dá)極顯著和顯著水平，表2～4同。

2.2 花齡對春蘭花粉活力的影響

從圖2可見，春蘭5個品種花粉活力最高時(shí)期為花后1 d。由表2可見，此時(shí)，強(qiáng)活力花粉染色率也最高，色花-2 d略高于1 d，但差異不顯著。與大花蕙蘭情況不同，春蘭在花前2 d(-2 d)有3個品種(汪字、色花和雪山)的花粉活力較高，染色率在80%以上，其余2個品種(新月佩、集圓)僅為60%左右。而花齡超過4 d，花粉活力下降顯著，至花后10 d，色花和集圓有活力花粉已不足40%?？梢姡禾m品種間花粉活力趨勢表現(xiàn)差別較大，新月佩和集圓花苞開放時(shí)花粉活力較高，但4 d后活力下降明顯；雪山和汪字在整個測定時(shí)期均活性較強(qiáng)(染色率60%以上)；而色花的花粉僅在花前2 d和花后1 d活性較強(qiáng)，其他花齡顯著降低，說明該品種強(qiáng)花粉活力時(shí)期短暫，在以該品種為父本進(jìn)行雜交授粉時(shí)應(yīng)予以注意。

圖2 不同花齡春蘭TTC染色情況

花齡/d強(qiáng)活力花粉染色率/%弱活力花粉染色率/%色花新月佩集圓汪字雪山色花新月佩集圓汪字雪山-230.41aA11.51dD13.82dD33.22bB28.74bAB53.16abAB50.45aA46.39abA50.88aA54.22aA129.50aA32.39aA38.85aA45.88aA32.16aA55.48aA50.94aA45.43abA44.23bB52.53abA411.91bB26.76bB32.05bB32.62bB27.46bB50.94bB48.40abAB48.07aA47.36abAB49.82bA77.54cC17.66cC21.30cC24.84cC21.23cC42.64cC45.29bB43.24bA46.44abAB49.45bA104.72dC12.63dD5.40eE19.94dC13.20dD34.66dD39.81cC34.66cB45.25bAB49.74bA

2.3 花齡對蕙蘭花粉活力的影響

圖3表明，蕙蘭品種花粉活力普遍較高，除HL-4開花前期活性稍差，其余材料在各花齡期的TTC染色率均超過70%。表3顯示，從整體趨勢來看，蕙蘭花粉在整個所測花齡期均能保持較高的活力，然而分別觀察強(qiáng)、弱花粉活力數(shù)量發(fā)現(xiàn)，開花4 d及之前強(qiáng)活力花粉比例顯著高于其他時(shí)期，說明即使花粉總活力相差不大，但早期開花的強(qiáng)活力花粉占優(yōu)勢，可能對授粉坐果產(chǎn)生一定的影響。

圖3 不同花齡蕙蘭TTC染色情況

表3 不同花齡蕙蘭強(qiáng)、弱活力花粉染色率

2.4 花齡對墨蘭花粉活力的影響

本試驗(yàn)選用的墨蘭品種中，花粉活力的變化曲線與春蘭接近。由圖4可見，除幸姬外，其余品種均表現(xiàn)為-2 d和1 d活力最強(qiáng)，且強(qiáng)活力花粉百分?jǐn)?shù)差異顯著，開花時(shí)間越長則活力下降越快，其降幅超過春蘭。表4顯示，當(dāng)花齡為10 d時(shí)，有活力花粉數(shù)量已降至50%以下，強(qiáng)活力花粉數(shù)最高僅為7.79%(白墨)，表明在開花后，隨著時(shí)間的推移，墨蘭花粉活力迅速減弱，授粉時(shí)間應(yīng)選擇開花當(dāng)天或花蕾含苞待放狀態(tài)時(shí)為好。

圖4 不同花齡墨蘭TTC染色情況

表4 不同花齡墨蘭強(qiáng)、弱活力花粉染色率

3 小結(jié)與討論

花粉活力測定常用的方法有離體萌發(fā)法、碘-碘化鉀染色法和TTC染色法。離體萌發(fā)法的人工培養(yǎng)基成分因物種不同而異，須篩選適宜的培養(yǎng)基成分和培養(yǎng)條件，對于萌發(fā)困難的物種需添加促萌發(fā)物質(zhì)，否則不足以代表花粉實(shí)際萌發(fā)狀況。由于蘭科植物花粉表面包裹了類脂膜，對花粉起到很好的包圍保護(hù)作用，使其在萌發(fā)和染色過程所需時(shí)間更長。據(jù)報(bào)道，臺灣金線蓮(AnoectochilusformosanusHayata)花粉塊的固體培養(yǎng)萌發(fā)需要48 h[7]；墨蘭最短為24 h，最長需48 h以上；大花蕙蘭最短需60 h，最長96 h，且大花蕙蘭花粉在篩選過的人工培養(yǎng)基上萌發(fā)時(shí)間較長，萌芽后很難繼續(xù)伸長，其人工培養(yǎng)有一定的難度[2-3]；碘-碘化鉀染色法根據(jù)花粉內(nèi)積累淀粉含量來間接判斷花粉活力，但不適用于大花蕙蘭和國蘭花粉活力測定[6]；TTC染色法的原理是活力強(qiáng)的花粉具有較強(qiáng)的呼吸作用，所產(chǎn)生的脫氫酶可將無色的氧化型還原成紅色的還原型，并將花粉自身染色。褚怡等[6]采用3種染色方法測定大花蕙蘭和部分國蘭的花粉活力，認(rèn)為TTC染色法是大花蕙蘭和國蘭花粉活力測定最直觀的方法。凌春英等[2]在比較了大花蕙蘭和墨蘭花粉離體培養(yǎng)法和TTC染色法后得出，TTC染色法所測定的結(jié)果略高于離體培養(yǎng)法，但兩種方法所得活力表現(xiàn)基本一致?；谝陨涎芯浚狙芯坎捎肨TC染色法快速、有效地測定蘭花花粉活性，操作簡便，耗時(shí)短，不受實(shí)驗(yàn)條件影響。

早在20世紀(jì)80年代，便有研究者對春蘭的花粉進(jìn)行電子顯微鏡和組織化學(xué)研究，闡明花粉壁結(jié)構(gòu)與花粉粘合的關(guān)系[8]，孫崇波等[9]利用掃描電鏡觀察了蘭科5個屬(包括蘭屬的6個種)的花粉塊形態(tài)。前人對蘭花花粉組織形態(tài)的研究為后期活性鑒定方法探索和花粉的再利用提供了科學(xué)依據(jù)。本研究分別鑒定了觀賞蘭屬4個種，包括大花蕙蘭、春蘭、蕙蘭和墨蘭各5個品種在不同花齡期的花粉活力，旨在確定不同開花時(shí)期的花粉活力變化趨勢，為雜交育種中最佳授粉時(shí)間的選擇和提高雜交成功率奠定基礎(chǔ)。

從總體趨勢來看，大花蕙蘭、春蘭、蕙蘭和墨蘭的花粉均以開花當(dāng)天及花苞待開放時(shí)活力較高，且呼吸作用強(qiáng)的花粉數(shù)所占比例最大，這與文心蘭的花粉活力表現(xiàn)一致[10]。大花蕙蘭和蕙蘭的花粉活力保持時(shí)間長，高活力時(shí)期分別能維持在花后8和10 d，與卡特蘭的花粉特性類似[11]；春蘭和墨蘭花粉高活力時(shí)期處于開花前4 d，而后逐漸減弱。隨著開花時(shí)間的延長，4個種的花粉活力均呈下降趨勢，以強(qiáng)活力花粉數(shù)占比變化最為明顯，品種之間具有一定的差異。大花蕙蘭和蕙蘭在整個測定時(shí)期活力較強(qiáng)，而春蘭和墨蘭花朵開放后花粉活力迅速喪失，其中墨蘭的表現(xiàn)尤為顯著。在后續(xù)的雜交育種工作，筆者檢驗(yàn)了部分品種花粉的授粉結(jié)實(shí)能力，初步驗(yàn)證了本研究得出的花粉活力變化趨勢與后續(xù)實(shí)際授粉結(jié)實(shí)情況表現(xiàn)一致(數(shù)據(jù)該文未列出)。然而，與本文結(jié)論不同的是，褚怡等[6]認(rèn)為大花蕙蘭與國蘭(春蘭、春劍、蓮瓣蘭)的花粉活力隨著開花時(shí)間的延長，經(jīng)歷從弱變強(qiáng)再變?nèi)醯倪^程。這種在種屬不同品種間差異較大的情況，可能與參試品種特性、測定時(shí)間、栽培環(huán)境條件以及取材時(shí)植株的營養(yǎng)狀態(tài)有關(guān)。

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