王曉飛 史翠娟 闞光鋒 李亮 文華 周婷

(1哈爾濱工業(yè)大學(威海)功能食品研究室,山東 威海 264209;2山東大學(威海)海洋學院,山東 威海 264209)

0 引言

紅酵母是海洋微生物的優(yōu)勢種群,廣泛存在于世界各個海域、南北極及深海等領域[1-3]。海洋是一個高壓(深海)、低營養(yǎng)、低光照,以及溫度和鹽度變化巨大的獨特環(huán)境,從而使其中的酵母細胞內代謝和產物有異于陸地環(huán)境生存的酵母。海洋紅酵母細胞含有豐富的蛋白質、類胡蘿卜素、多糖、蝦青素、不飽和脂肪酸、必需氨基酸、消化酶類、維生素等活性代謝產物,具有較高的營養(yǎng)價值和活性作用,不僅用以生產類胡蘿卜素、單細胞蛋白和生物柴油,還可用于微生態(tài)制劑,凈化水質,在醫(yī)藥、食品、化工、農業(yè)和環(huán)保等領域有著廣泛的應用[4-5]。

海洋紅酵母大小約為 4—6 μm,營養(yǎng)物質豐富,適口性好,不易沉淀,有較好的耐鹽性,同時還具有培養(yǎng)周期短、適應能力強、成本低等優(yōu)點,非常適宜作為海產動物幼體的開口餌料和幼體時期的補充性餌料,能顯著提高水產動物幼苗存活率,提高飼料利用率,增強動物體免疫力,凈化水體,是生態(tài)養(yǎng)殖的優(yōu)良添加劑[6-7]。海洋紅酵母作為養(yǎng)殖微生態(tài)制劑在水產養(yǎng)殖業(yè)中已經有廣泛的應用,并推廣到了廣西、海南、江蘇、浙江、山東等十幾個省市[8]。

與一般海洋環(huán)境相比,南極具有低溫、高鹽、低光照、寡營養(yǎng)、強輻射等極端環(huán)境特點,孕育了包括酵母在內的豐富的低溫微生物資源,能夠產生獨特的代謝物質[9]。因此,本研究以極地紅酵母Rhodotorula mucilaginosaAN5為實驗對象,研究其發(fā)酵培養(yǎng)的最佳生長條件,初步探討作為養(yǎng)殖微生態(tài)制劑在水產養(yǎng)殖業(yè)中應用的可能性。

1 材料與方法

1.1 實驗菌株

海洋極地酵母Rhodotorula mucilaginosaAN5是從第22次南極科學考察采集的海冰樣品中分離所得。

1.2 酵母培養(yǎng)基及培養(yǎng)

YPD培養(yǎng)基: 葡萄糖2.0 g,蛋白胨2.0 g,酵母粉1.0 g,pH=6.0,海水100 mL,0.1 MPa下滅菌30 min。將活化4 d的酵母接種于液體YPD培養(yǎng)基中,120 r·min–1,20℃搖床培養(yǎng)。

1.3 酵母密度測定

采用顯微計數法[10]。

1.4 海參的養(yǎng)殖

實驗用海參為仿刺參幼苗,購自山東威海,長約0.5—0.8 cm。將幼參隨機分到6個玻璃缸中人工養(yǎng)殖(3個為對照組,3個為實驗組),每天定時投喂等量人工配合飼料,實驗組每天另投喂0.3 g紅酵母,每2天換水1/2,2個月后,收集海參,吸干表面水分,?20℃保存。

1.5 成分測定方法

水分含量測定采用國標GB5009.3—2010直接干燥法[11]; 蛋白質含量測定根據國標 GB5009.5—2010凱氏定氮法[12]; 粗脂肪含量測定采用索氏抽提法[13]; 多糖含量測定采用亞甲基藍比色法[14]。

1.6 數據分析

試驗數據為 3次生物學重復平均所得,以平均值±標準誤差表示,用軟件 SPSS 15.0中的one- way ANOVA進行方差分析和差異顯著性比較,P<0.05為差異顯著,P<0.01為極顯著差異。

2 結果與分析

2.1 培養(yǎng)條件對酵母發(fā)酵生長的影響

2.1.1 碳源對酵母生長的影響

分別以2%的玉米淀粉、蔗糖、糖蜜、玉米面、豆面、小米面代替YPD培養(yǎng)基中的葡萄糖,其他成分和培養(yǎng)條件不變,4 d后顯微計數法測定菌體密度(圖1)。6種碳源物質中,以糖蜜為碳源進行發(fā)酵培養(yǎng)時,酵母細胞密度達到最大值 1.19×107cells·mL–1,其次為小米面 0.91×107cells·mL–1,玉米淀粉、玉米面、豆面和蔗糖都約為 0.65×107cells·mL–1,顯著小于前2種。糖蜜含有海洋紅酵母生長所必需的營養(yǎng)成分、維生素及微量元素等,發(fā)酵時明顯優(yōu)于其他碳源[15]。同時糖蜜是大宗廉價原料,價格便宜,綜合考慮發(fā)酵菌量與生產成本,糖蜜為酵母菌培養(yǎng)的最佳碳源。分別以1.0%、2.0%、3.0%和4.0%濃度的糖蜜培養(yǎng)紅酵母,酵母細胞密度見圖2。結果發(fā)現2%的糖蜜發(fā)酵液中酵母細胞密度最大,為1.46×107cells·mL–1,明顯高于其他濃度,由此確定2%糖蜜為酵母培養(yǎng)的最佳碳源。

圖1 不同碳源對南極紅酵母AN5發(fā)酵的影響Fig.1.Effect of different carbon sources on Antarctic yeast AN5 growth

圖2 糖蜜濃度對南極酵母AN5發(fā)酵的影響Fig.2.Effect of different molasses concentration on Antarctic yeast AN5 growth

2.1.2 氮源對酵母發(fā)酵的影響

以上述優(yōu)化的 2%的糖蜜為碳源,分別以液體玉米漿、固體玉米漿、糖蜜、玉米面、酵母粉、黃豆餅粉、蛋白胨、大豆蛋白胨、硫酸銨、硝酸鉀為氮源,發(fā)酵培養(yǎng) 4 d后,測定酵母細胞密度(圖3)。在10種氮源物質中,對AN5生長量的作用大小為酵母粉>大豆蛋白胨>蛋白胨>玉米面>固體玉米漿>硝酸鉀>液體玉米漿>糖蜜>黃豆餅粉>硫酸銨。在8種有機氮源中,以酵母粉作為氮源進行發(fā)酵培養(yǎng)時,酵母細胞密度達最大值1.3×107cells·mL–1,因此選取酵母粉作為發(fā)酵培養(yǎng)的最佳氮源,與楊鶯鶯等[16]的研究結果一致。兩種無機氮源中,硝態(tài)氮的作用效果遠高于銨態(tài)氮,楊鶯鶯等[16]對酵母RH1的發(fā)酵研究表明,硫酸銨和氯化銨作氮源時生長緩慢,與本研究結果一致。篩選出最佳氮源后,分別以0.25%、0.50%、0.75%和1.0%酵母粉濃度培養(yǎng)酵母(圖4)。有圖可知,以濃度為 0.5%的酵母粉進行發(fā)酵培養(yǎng)時,發(fā)酵液中酵母細胞密度可以達到2.03×107cells·mL–1,隨酵母粉濃度增加酵母細胞密度基本不變?？紤]到發(fā)酵的密度和成本,選擇0.5%酵母粉為酵母培養(yǎng)的最佳氮源。

圖3 不同氮源對南極酵母AN5發(fā)酵的影響Fig.3.Effect of different nitrogen sources on Antarctic yeast AN5 growth

圖4 酵母粉濃度對南極酵母AN5發(fā)酵的影響Fig.4.Effect of different yeast powder concentration on Antarctic yeast AN5 growth

2.1.3 初始pH對酵母生長的影響

以上述優(yōu)化的碳氮源為培養(yǎng)基,調節(jié)初始pH值,使其 pH值分別為 2.0、3.0、4.0、5.0、6.0、7.0、8.0,培養(yǎng) 4 d后測定菌體的密度(圖5)。當pH=3.0時,發(fā)酵液中酵母細胞密度最大,為1.19×107cells·mL–1; 當pH=2.0 時,菌體密度迅速下降,達到最低密度值 0.32×107cells·mL–1; 當pH>3時,隨 pH的增大,細胞密度變小,但下降緩慢,pH=8.0 時密度仍為 0.54×107cells·mL–1。由此可知,海洋酵母細胞培養(yǎng)的最適初始 pH=3.0,顯著低于常溫酵母最適pH為4.0—5.0的報道[5,16]。

2.1.4 溫度對酵母生長的影響

以上述優(yōu)化的碳氮源為培養(yǎng)基,分別在10℃、15℃、20℃、25℃和30℃下培養(yǎng)酵母菌,4 d后酵母細胞密度見圖6。由圖可知,當溫度從10℃升高到20℃時,菌體密度達到最大值 0.96×107cells·mL–1。其后隨溫度的繼續(xù)升高,酵母密度顯著下降。因此,AN5菌株生長的最適溫度為20℃,發(fā)酵時應控制在這一溫度。酵母菌的最適生長溫度因種屬或菌株的來源不同而有所差別,楊鶯鶯等[16]和童應凱等[17]發(fā)現海洋紅酵母Rhodotorulasp.的最佳培養(yǎng)溫度為28℃,郭馨澤等[18]實驗證明海洋紅酵母003菌株的最佳生長溫度為22℃。實驗中所用酵母為海洋極地酵母,屬適冷酵母種類,在低溫環(huán)境下仍能保持活力,一般低于常溫酵母的最適生長溫度25—28℃[5]。

圖5 初始pH對南極酵母AN5生長的影響Fig.5.Effect of different initial pH on Antarctic yeast AN5 growth

圖6 溫度對南極酵母AN5生長的影響Fig.6.Effect of different temperature on Antarctic yeast AN5 growth

2.1.5 裝液量對酵母生長的影響

在250 mL的三角瓶中加入培養(yǎng)基和酵母種子液,使其終體積分別為30、50、70、90、110、130、150 mL,4 d后對菌液密度進行測定(圖7)。當裝液量為 50 mL時,酵母細胞密度達最大值0.99×107cells·mL–1; 裝液量為 30 mL和70 mL時,細胞密度顯著降低; 當裝液量大于70 mL時,菌體密度無顯著變化,維持在 0.58×107cells·mL–1。裝液量的不同對酵母菌生長的影響體現在兩個方面:(1)裝液量越大,營養(yǎng)物質含量越多,為酵母菌的生長提供物質保證;(2)裝液量越大意味著剩余空間越小,三角瓶內空氣越少,隨著時間增加,瓶內氧氣消耗,廢氣增多,對酵母菌的生長起到抑制作用。本實驗中,50 mL/250 mL的裝液量為酵母生長的最佳體積,與郭馨澤等[18]的研究結果一致。

圖7 裝液量對南極酵母AN5發(fā)酵的影響Fig.7.Effect of different liquid volume on Antarctic yeast AN5 growth

2.1.6 轉速對酵母生長的影響

以優(yōu)化的碳氮源為培養(yǎng)基,裝液量為 50 mL/250 mL,設置搖床的轉速分別為80、100、120、140、160 和 180 r·min–1,4 d 后對菌液密度進行測定(圖8)。由圖8可以看出,隨著搖床轉速的增加,酵母發(fā)酵密度呈上升趨勢,由 80 r·min–1時的0.93×107cells·mL–1到 140 r·min–1時的1.59×107cells·mL–1,增加了 71%。此后,隨轉速的升高,菌體密度幾乎無變化,故本實驗的最佳搖瓶轉速為140 r·min–1。搖瓶培養(yǎng)的轉速和裝液量對菌體發(fā)酵密度的影響因素基本一致,影響培養(yǎng)基中氧氣的含量,轉速越高,培養(yǎng)基中氧氣的含量增加,利于酵母菌的生長繁殖,但當氧氣含量達到一定限度后,酵母菌的密度就不再增加。

圖8 轉速對南極酵母AN5發(fā)酵的影響Fig.8.Effect of different rotation rate on Antarctic yeast AN5 growth

經上述條件優(yōu)化,得到了極地紅酵母AN5的最佳發(fā)酵條件,此時酵母密度達到 5.81×107cells·mL–1,與周鮮嬌等[19]的研究結果類似,但低于其他常溫紅酵母[16,18]。

2.2 極地紅酵母主要成分含量的測定

以優(yōu)化后的培養(yǎng)條件大量發(fā)酵紅酵母 AN5,所得菌體進行水分和主要營養(yǎng)成分的測定。經測定,極地紅酵母AN5的平均含水量為69.15%。主要營養(yǎng)成分測定結果見表1,從表中可以看出,干酵母中粗蛋白含量約為42.00%,與常溫紅酵母中蛋白質含量相似,符合水產養(yǎng)殖中養(yǎng)殖動物對生物餌料的蛋白需求[20]。粗脂肪含量僅為0.39%,顯著低于蔡詩慶等[21]測定的4.67%—6.35%?？偺鞘巧矬w能量的主要來源,酵母菌AN5的總糖含量為 32.08%,高于常溫酵母[14,22],充足的糖類可被用以生物體生長能源的消耗,在水產養(yǎng)殖中發(fā)揮重要作用[23]。

表1 紅酵母Rhodotorula sp.的主要營養(yǎng)成分Table 1.Main nutrient composition in several red yeasts Rhodotorula sp.

2.3 極地紅酵母對幼參水分和主要營養(yǎng)成分的影響

以每天投喂0.3 g鮮酵母喂養(yǎng)海參幼苗,2個月后,測定海參體內的水分和主要營養(yǎng)成分含量(圖9)。正常養(yǎng)殖的海參,含水量為92.02%,投喂紅酵母的海參,含水量為 91.83%,水分含量沒有顯著差異; 投喂紅酵母后,蛋白質干重由 35.84%增加到 43.19%,含量顯著提高; 脂肪含量由7.77%變?yōu)?.95%,無明顯變化; 但添加紅酵母的海參中多糖的含量為 6.75%干重,較對照的5.46%增加了23.63%。

圖9 南極酵母AN5作為微生態(tài)制劑對海參主要成分的影響.*表示對照組和實驗組之間差異顯著(P<0.05)Fig.9.Effect of Antarctic yeast AN5 as microecologics on main components of juvenile sea cucumber

3 討論

3.1 酵母菌的發(fā)酵生產

酵母菌的大規(guī)模發(fā)酵生產是紅酵母應用的前提和基礎?？茖W家研究發(fā)現,不同的培養(yǎng)條件和發(fā)酵工藝會影響海洋紅酵母的生物量,通過調整培養(yǎng)基中碳源、氮源、無機鹽、生長因子等物質的種類和添加量,改變培養(yǎng)過程中的pH值、接種量、裝液量、通氣量等條件,可顯著提高酵母菌的產量[14,18]。本實驗所用碳氮源均為工業(yè)發(fā)酵原料,廉價易得,經過發(fā)酵工藝的優(yōu)化,酵母細胞密度增加了6.21倍,達到了常溫酵母發(fā)酵的生物量,為酵母細胞的大規(guī)模發(fā)酵生產奠定了基礎。但本實驗僅對單一的碳氮源進行了篩選,已有研究表明多種營養(yǎng)物質的組合更有利于酵母的生長[18-19],這是下一步研究的方向。另外,該研究只以生物量為指標進行了發(fā)酵優(yōu)化,發(fā)酵條件對主要功能活性因子的影響有待進一步研究,以提高酵母菌的營養(yǎng)價值。值得一提的是,該紅酵母的最佳發(fā)酵溫度為 20℃,最適初始 pH為3.0。低溫和低pH值培養(yǎng)可抑制雜菌的生長、減少污染。

3.2 紅酵母作為飼料添加劑的應用潛力

紅酵母是一種在海洋中廣泛存在的單細胞微生物,復雜的生存環(huán)境造就了體內獨特的代謝產物和活性物質[5],且酵母本身無毒副作用,安全性高[24],在果實保鮮[25-26]、畜禽養(yǎng)殖[27-28]等方面有著廣泛的應用。

海洋紅酵母及其發(fā)酵產物富含蛋白質、糖類、蝦青素、維生素、礦物質等,含有較多的必需氨基酸,營養(yǎng)全面,是集營養(yǎng)與保健為一體的養(yǎng)殖微生態(tài)制劑,這些特殊營養(yǎng)成分彌補了常規(guī)餌料(或添加劑)的營養(yǎng)缺陷,可以提高水產動物抵抗力,減少抗生素的使用,提高水產品質量[29]。海洋紅酵母Rhodotorulasp.作為微生物餌料在水產苗種培育領域的應用始于20世紀90年代,科學家們進行了大量的研究。陳昌福等[30]和Yang等[31]研究發(fā)現,餌料中添加海洋紅酵母能夠提高對蝦的成活率和生長速率,使血清中抗氧化酶系統(tǒng)活性增強,增加對環(huán)境因子的耐受力。孫建男等[5]綜述文獻指出,海洋紅酵母對養(yǎng)殖動物的生長免疫有明顯的促進作用,可能是由于酵母生長中產生的消化酶類、維生素、生長因子等,促進了動物的消化吸收,提高了飼料的利用率。但張瑞玲等[32]在白魚粉為主的大菱鲆飼料中添加海洋紅酵母,則不能提高大菱鲆的攝食和生長性能。

本研究中,極地紅酵母蛋白質和多糖的含量較高,作為微生態(tài)制劑應用于幼參的養(yǎng)殖中,能顯著提高海參中蛋白和多糖的含量。海參飼喂酵母后,可在幼參體內存活定殖[33-34],體內超氧化物歧化酶、多酚氧化酶、過氧化氫酶、酸性磷酸酶、堿性磷酸酶、溶菌酶、淀粉酶、纖維素酶、褐藻酸酶、一氧化氮合酶、胰酶、脂肪酶等酶類活性顯著升高[34-39],促進了餌料的消化和吸收,使海參體內的蛋白質和多糖等主要營養(yǎng)成分物質含量增加[35],對生長具有較明顯的促進作用[2,40],免疫反應增強,抗病力和存活率提高[33,36-38]。同時,紅酵母作為營養(yǎng)型生物餌料直接為稚參提供營養(yǎng)物質,可提高海參幼體變態(tài)率和成活率[41]。除此之外,酵母具有較高的硝化能力,可有效去除海參養(yǎng)殖污水中的亞硝酸鹽,改良養(yǎng)殖水質[42]。這些研究為酵母在海參養(yǎng)殖中的應用奠定了理論基礎。

南極紅酵母易于大規(guī)模發(fā)酵生產,且營養(yǎng)價值豐富,具有作為水產餌料生物的潛力,是較好的飼料原料,可用作魚粉等蛋白源的替代物,具有良好的市場前景和開發(fā)潛力。

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