陳 健 綜述 鐘士江 審校

肌萎縮側(cè)索硬化癥(amyotrophic lateral sclerosis，ALS)是一組病因未明的選擇性侵襲脊髓前角細胞、腦干運動神經(jīng)元、皮質(zhì)椎體細胞及錐體束的一類慢性進行性疾病。ALS分為散發(fā)型和家族型，已經(jīng)發(fā)現(xiàn)包括C9ORF72、FUS、Ataxin-2、SMN1/2等基因與ALS的發(fā)病存在一定關(guān)系，在大多數(shù)ALS患者運動神經(jīng)元或膠質(zhì)細胞內(nèi)都可以找到異常蓄積的蛋白，如異常的SOD1、TDP-43蛋白，這種異常的蛋白蓄積可能對ALS發(fā)病有重要影響。利魯唑和依達拉奉是目前被認可治療ALS患者有效的藥物，但僅僅能增加患者幾個月的生存期。雖然臨床治療選擇有限，不過隨著一種叫做基因沉默(Gene silencing)技術(shù)的出現(xiàn)，給ALS患者帶來了曙光。本文著重探討針對ALS的基因治療前景。

1 ALS起病的分子研究

脊髓肌萎縮側(cè)索硬化是一種起病隱襲的神經(jīng)系統(tǒng)變性疾病，隨著病程進展，患者出現(xiàn)不可逆性肌無力和萎縮、延髓麻痹及錐體束癥，腦和脊髓運動神經(jīng)元受損明顯，逐漸蔓延至全身肌肉，包括呼吸肌，患者大多在3到5年內(nèi)進展為呼吸衰竭[1]。

絕大多數(shù)ALS患者是病因未明的(散發(fā)型)，但有約10%的患者是家族遺傳性的，在這部分家族患者中，又有約20%是因為超氧化物歧化酶1(Superoxide dismutase 1，SOD1)基因突變造成的，這也是第一個被發(fā)現(xiàn)的ALS致病基因。雖然目前針對SOD1的研究仍未明確，但目前較為統(tǒng)一的觀點是SOD1蛋白的錯誤折疊和不穩(wěn)定構(gòu)象導(dǎo)致的異常SOD1蛋白蓄積在病因中起關(guān)鍵作用。

除此之外其他的常見突變基因也被認為在ALS的發(fā)病中具有重要作用，TDP-43本身是一種轉(zhuǎn)錄抑制因子，也是第一個被鑒別的在ALS和前額葉癡呆患者細胞質(zhì)內(nèi)異常聚集物的主要成分[2]。TDP-43蛋白的異常蓄積在大多數(shù)ALS患者運動神經(jīng)元細胞中可以看到，正常的TDP-43在細胞質(zhì)內(nèi)合成，大部分轉(zhuǎn)運入細胞核參與調(diào)節(jié)轉(zhuǎn)錄、選擇性剪接、mRNA修飾等作用，異常的細胞質(zhì)內(nèi)TDP-43蛋白蓄積卻造成了細胞受損、線粒體破壞，有意思的是由編碼TDP-43的TARTDP突變導(dǎo)致的異常TDP-43蓄積只占到了3%～6%[3]。另外除了已知的C9ORF72、FUS、Ataxin-2、SMN1/2等基因，目前也有研究發(fā)現(xiàn)TBK1、NEK1、PFN1、MATR3、CHCHD10、TUBA4A等基因可能與ALS起病存在關(guān)聯(lián)[4]。

可見細胞內(nèi)的異常蛋白蓄積都可能與ALS的發(fā)生有關(guān)，為此利用小分子RNA(siRNA)干擾特定靶mRNA降解(基因沉默技術(shù))，減少異常蛋白產(chǎn)生或者蓄積可能會成為治療ALS的良策。

2 ALS的基因治療進展

2.1 基因沉默減少異常SOD1蛋白蓄積 目前研究認為ALS并不是單一基因?qū)е碌幕虿?，已發(fā)現(xiàn)大于30余種基因與ALS起病有關(guān)。超氧化物歧化酶編碼的SOD1蛋白主要阻止過氧化硝酸亞離子的形成，起到抗氧化作用，自從成功制備了ALS病理鼠模型(SOD1-G93A鼠)以來，對SOD1基因的靶向治療就一直處于研究中。Rakhit、Peters等[5,6]在體內(nèi)和體外實驗中都發(fā)現(xiàn)了SOD1變異蛋白的錯誤折疊和聚集的證據(jù)。這提示我們異常的蛋白聚集很可能對ALS發(fā)生發(fā)展有重要影響，消除變異蛋白或許可以達到治愈ALS的目的。但是常規(guī)給藥在血腦屏障的阻擋下很難進入中樞神經(jīng)系統(tǒng)(CNS)，這給常規(guī)藥物治療帶來了難度。Stoica等[7]利用腺病毒AAV9攜帶microRNA在CNS中實現(xiàn)了長期廣泛的轉(zhuǎn)導(dǎo)，包括神經(jīng)元和膠質(zhì)細胞，令人欣喜的是并沒有看到明顯的病毒神經(jīng)毒性作用，不僅如此，最重要的是通過治療將SOD1-G93A鼠的中位生存期延長了50%。

這種治療與轉(zhuǎn)導(dǎo)病毒的方式、時間及種類有很大關(guān)系，不同的轉(zhuǎn)導(dǎo)方法可能導(dǎo)致不同結(jié)果。Borel等[8]發(fā)現(xiàn)利用鞘內(nèi)注射重組腺病毒rAAV10攜帶人造miRNA可以很好地實現(xiàn)整個脊髓上的運動神經(jīng)元內(nèi)表達，然而Samaranch等[9]發(fā)現(xiàn)利用重組rAAV9病毒載體則主要轉(zhuǎn)導(dǎo)星形細胞。這提示不同的病毒載體對轉(zhuǎn)導(dǎo)的目的細胞不同。另外影響的細胞類型不同，對生存的提升幅度也不同。Dirren等[10]發(fā)現(xiàn)通過主要沉默新生G93A鼠運動神經(jīng)元的突變SOD1時，即使在老鼠終末期神經(jīng)保護也可以達到83%～92%，而主要抑制星形細胞SOD1則只有54%～62%，但這兩者都好于對照組(33%～38%)。除此之外，最近的研究發(fā)現(xiàn)利用不同的載體啟動子，能實現(xiàn)更特異性的細胞轉(zhuǎn)導(dǎo)，比如Dirren等[11]使用小膠質(zhì)纖維酸蛋白啟動子(gfaABC1D)可以增加對星形細胞的表達，McLean等[12]發(fā)現(xiàn)利用人類突觸蛋白啟動子(hSYN1)的病毒則主要在神經(jīng)元中轉(zhuǎn)導(dǎo)，這意味著我們可以進一步提高基因沉默技術(shù)的靶向性，實現(xiàn)更有效率的定點基因治療。

除了上述因素外，研究發(fā)現(xiàn)注射時間、載體的種類都會對轉(zhuǎn)導(dǎo)效果產(chǎn)生影響。例如以AAV9-CB-GFP注射到P1和P21的G93A-SOD1鼠，三星期后用GFP免疫熒光檢查脊髓運動神經(jīng)元的轉(zhuǎn)導(dǎo)率分別為(62 ± 1)%和(8 ± 1)%，而星形細胞分別為 (34±2)%、 (54±3)%，提示越早注射病毒，對神經(jīng)元影響越大。研究者還發(fā)現(xiàn)AAV9病毒具有持久的CNS轉(zhuǎn)導(dǎo)能力，即使在終末期老鼠的星形細胞內(nèi)依然發(fā)現(xiàn)病毒表達，P1: (42±2)%, P21:(61±2)%，這說明AAV9病毒載體可以持續(xù)的在CNS中表達[13]。最近一項反義寡核苷酸沉默(ASOs)SOD1基因的臨床Ⅰ期實驗已經(jīng)結(jié)束，證明了載體病毒可以很好的被人體耐受，并且在腦脊液和血液中達到了預(yù)期的濃度[14]。

雖然前景巨大，但目前將基因沉默技術(shù)運用到臨床仍然受到了限制，首先SOD1-G93A鼠不能完全代表ALS患者，其次SOD1蛋白蓄積所致的ALS僅占了所有ALS患者的一部分，下一步還需要更多的研究去明確其他的相關(guān)基因。

2.2 基因沉默減少異常TDP-43蛋白蓄積 盡管有許多研究已經(jīng)證明了針對SOD1的抗寡核苷酸和RNAi治療在嚙齒類動物模型的有效性，但是實際上對ALS的研究作用卻非常有限，因為SOD1突變在ALS患者發(fā)病病因中僅占2%～5%。但是幾乎所有的ALS患者體內(nèi)都可以找到RNA連接蛋白TDP-43在神經(jīng)細胞內(nèi)異常聚集[2]，所以針對TDP-43的研究對于未來治療ALS更有潛力。TDP-43是具有多種功能的核酸結(jié)合蛋白，主要負責調(diào)控RNA代謝、轉(zhuǎn)錄、運輸，穩(wěn)定等一系列作用，在正常細胞核內(nèi)是必需的，但是在絕大多數(shù)ALS患者神經(jīng)細胞胞質(zhì)中都可以看到異常泛素化和高磷酸化的TDP-43聚合體，伴隨核內(nèi)正常的TDP-43蛋白減少。

現(xiàn)在已經(jīng)有不少研究者認為正是異常積聚在細胞質(zhì)的TDP相關(guān)聚合物導(dǎo)致了細胞毒性，而這毒性損傷很可能與ALS發(fā)病存在重大聯(lián)系。異常的TDP-43聚合蛋白不僅是ALS的病理標志，也在約50%的前額葉癡呆(frontal lobe dementia，F(xiàn)TD)患者身上發(fā)現(xiàn)了它的存在。令人欣喜的設(shè)想是減少異常TDP-43的聚集就有可能治愈ALS。但是最初的研究發(fā)現(xiàn)TDP-43對小鼠的生存是不可或缺的，Wu等[15]發(fā)現(xiàn)利用基因敲除TDP-43得到的小鼠常在胚胎期就無法存活，不僅如此，Iguchi等[16]還發(fā)現(xiàn)丟失TDP-43的老鼠會出現(xiàn)類似ALS患者的運動神經(jīng)元受損的癥狀，這提示正常TDP-43在維持運動神經(jīng)元功能方面至關(guān)重要，而且TDP-43正常功能受損可能會導(dǎo)致ALS。有趣的是不僅敲除TDP-43會出現(xiàn)這樣的情況，即使增加表達，依然會導(dǎo)致類似ALS的運動神經(jīng)元受損行為。

TDP-43是細胞賴以生存的必須蛋白，直接敲除TDP-43并不是一種可行的方法。但是Becker等[17]發(fā)現(xiàn)另一種蛋白質(zhì)ataxin-2對TDP-43形成異常聚合物有一定幫助，所以通過減少ataxin-2蛋白來抑制TDP-43的異常聚合或許是一個好途徑。Becker利用病毒沉默ALS小鼠ataxin-2基因，特別是將ataxin-2基因降到正常值一半的病鼠生存期較對照組明顯延長，并且更值得驚訝的是完全沉默ataxin-2基因的病鼠中位生存期較對照組延長了80%，研究者想利用這個原理利用反義寡核苷酸沉默ataxin-2來造福ALS患者。但是針對已經(jīng)發(fā)病的ALS患者，這一技術(shù)還需要在安全、倫理等方面進行探討。另一方面科學(xué)家也發(fā)現(xiàn)ataxin-2在2型脊髓小腦共濟失調(diào)癥中也有重要作用，利用ASO沉默ataxin-2不但可以延緩SCA2的發(fā)病而且沒有引起膠質(zhì)細胞的活躍，這意味沒有引起CNS中的炎性反應(yīng)，因為小膠質(zhì)細胞是CNS中的先天性免疫細胞，在幾乎所有類型的ALS患者中都會發(fā)現(xiàn)小膠質(zhì)細胞的活化，可見沉默ataxin-2有望成為治療TDP-43異常的一種可行方法。

另外研究者發(fā)現(xiàn)PABPN1與TDP-43有很強的交互作用，PABPN1可以抑制TDP-43的毒性蓄積，也可以促進異常胞質(zhì)TDP-43溶解及正常核TDP-43的恢復(fù)[18]，對治療TDP-43異常蓄積乃至逆轉(zhuǎn)ALS病情提供了一條新思路。研究者已經(jīng)發(fā)現(xiàn)異常的TDP-43主要在神經(jīng)細胞線粒體內(nèi)，并且調(diào)控線粒體mRNA表達，特別是線粒體內(nèi)呼吸復(fù)合體Ⅰ子單元ND3和ND6，當沉默異常TDP-43后，可以阻止細胞內(nèi)線粒體功能紊亂和神經(jīng)元丟失，該研究也證明了在ALS患者線粒體內(nèi)TDP-43比健康人體內(nèi)的明顯增多，同時通過阻止TDP-43進入線粒體，取得了驚人的改善，這為以后治療ALS提供了一種可行的辦法，目前該團隊正在繼續(xù)研究阻止TDP-43進入人類神經(jīng)細胞線粒體的小型蛋白質(zhì)[19]。

綜上，異常的蛋白蓄積涉及氧化應(yīng)激、mRNA調(diào)控、線粒體紊亂等多個方面，對ALS的發(fā)生發(fā)展有不可忽視的重要作用，盡管其具體機制仍然未明，但是基因沉默技術(shù)已經(jīng)為人類帶來了一縷曙光。

2.3 其他 目前已知與ALS相關(guān)基因約有30種，其中最常見的是C9ORF72、FUS、SOD1、TARDBP等，但還有很多未知的導(dǎo)致ALS的基因仍然有待探究。C9ORF72就是一個正在深入研究的代表，它是已知的ALS發(fā)病相關(guān)基因中占比例最多的，在細胞內(nèi)膜運輸、自噬中都發(fā)揮作用，研究已經(jīng)發(fā)現(xiàn)減少正常的C9ORF72蛋白也會導(dǎo)致神經(jīng)毒性作用，這可能與C9ORF72影響自噬有關(guān)。C9ORF72的非編碼區(qū)有一段跨物種高度保守GGGGCC序列，位于人常染色體9P21，研究者發(fā)現(xiàn)在11.7%FTD和23.5%FALS中都可以找到這一段六核苷酸序列的大量重復(fù)，重復(fù)可達數(shù)百乃至上千，然而在健康人這一重復(fù)僅有2～23。在一項小規(guī)模研究的ALS或FTD患者中這一重復(fù)為700～1600[20]。已發(fā)現(xiàn)在C9ORF72擴增相關(guān)的ALS中，C9ORF72會表達兩種不同的mRNA，一種稱之為“正義”轉(zhuǎn)錄，另一種為“反義”轉(zhuǎn)錄，并且會產(chǎn)生許多的二肽重復(fù)蛋白(DPRs)，這些重復(fù)蛋白都有細胞毒性。Kramer等[21]發(fā)現(xiàn)了酵母轉(zhuǎn)錄因子Spt4(人類中被稱為SUPT4H)調(diào)控長的重復(fù)基因區(qū)域的伸長，而不是短的區(qū)域伸長，通過減少酵母里Spt4數(shù)量，能夠減少C9ORF72擴張所導(dǎo)致的三種產(chǎn)物，改善生存狀況，同樣在ALS患者的細胞，沉默SUPT4H1基因也有類似的結(jié)果，這可能為治療C9ORF72導(dǎo)致的ALS提供了希望。不足的是目前使用的C9ORF72突變小鼠可以表現(xiàn)人類C9ORF72相關(guān)的ALS的分子特征，但是并沒有表達出相應(yīng)的運動受損，這對下一步培育更合理的C9ORF72相關(guān)ALS模型動物提出了更高的要求。

其他的基因還有如修正基因EPHA4，低劑量的EPHA4可以幫助ALS患者獲得更長的生存期，這可能與促進軸突功能增強有關(guān)。隨著全基因測序技術(shù)的成熟，逐漸又發(fā)現(xiàn)了TBK1基因突變與ALS的關(guān)系，目前認為TBK1可以磷酸化許多自噬相關(guān)蛋白如OPTN2及P62，所以TBK1導(dǎo)致的ALS可能與細胞自噬清除異常蛋白相關(guān)。

肌萎縮側(cè)索硬化無疑是一種多基因相關(guān)疾病，而大多數(shù)的基因突變都與產(chǎn)生異常mRNA有關(guān)，異常的蛋白可能直接作用C9ORF72，也可能與細胞正常功能受損相關(guān)，如SOD1、TDP的突變?？傊@種異常蛋白影響了運動神經(jīng)元功能紊亂或丟失，利用小分子RNA(shRNA)沉默變異蛋白或許是一條明智之舉。

3 展 望

過去人們已經(jīng)對ALS這一不治之癥提出了許多治療手段，但結(jié)局多不理想，動物模型上有效的干細胞移植在臨床階段的治療效果仍有爭議，可能與移植的干細胞無法精準到達神經(jīng)系統(tǒng)有關(guān)。將外源性的干細胞準確的移植到運動神經(jīng)元損傷的區(qū)域以及讓它們精確地恢復(fù)神經(jīng)傳導(dǎo)，在這方面還有待更多的研究。同時未來的干細胞移植不應(yīng)該僅僅局限于運動神經(jīng)元，也應(yīng)該關(guān)注膠質(zhì)細胞的移植[22]。另一方面神經(jīng)營養(yǎng)因子對促進受損神經(jīng)細胞的恢復(fù)再生也已經(jīng)證明了其效果，但是在將外源性營養(yǎng)因子(如胰島素樣生長因子)導(dǎo)入CNS中最開始碰到了阻力，后來科學(xué)家發(fā)現(xiàn)利用AAV病毒載體可以將類胰島素因子、腦膠質(zhì)源性營養(yǎng)因子成功的轉(zhuǎn)入中樞神經(jīng)系統(tǒng)，并且有了好的結(jié)果，這暗示著未來的治療將會與基因技術(shù)密不可分。現(xiàn)在還有一種CRISPR/Cas9基因編輯技術(shù)，CRISPR/Cas9最早是從細菌和古細菌的自我防御外源病毒感染機制中發(fā)現(xiàn)的，CRISPR/Cas9可以靶定特異基因，將人工合成的基因精確地在某個區(qū)域表達。CRISPR/Cas9作為一種新興的技術(shù)雖然目前發(fā)展還有限，但是在未來有著很大的潛力[23]。不過目前針對ALS的基因治療研究依然有著兩個很大的局限：(1)目前所得到的ALS動物模型并不能很好地概括ALS的病理機制及疾病進展，且病因復(fù)雜多樣，僅僅針對一種基因的動物模型在臨床上作用可能有限；(2)隨著基因沉默技術(shù)的發(fā)展，以減少SOD1毒性蛋白的蓄積為目的的RNAi及ASOs體外實驗作用明顯，但是在體內(nèi)試驗效果甚微，注入RNAi或ASOs在疾病早期效果較好，但臨床上大多是已經(jīng)發(fā)病的患者，針對ALS的治療依然需要更多的研究，未來的治療可能會是多種方法的綜合治療如基因沉默、干細胞移植、神經(jīng)營養(yǎng)等聯(lián)合治療。