曹兵兵，高昉，姜勇，金勝威

（1.溫州醫(yī)科大學(xué)附屬第二醫(yī)院 麻醉科，浙江 溫州 325027；2.南方醫(yī)科大學(xué) 病理生理學(xué)教研室廣東省功能蛋白質(zhì)組學(xué)重點(diǎn)實(shí)驗室，廣東 廣州 510515）

創(chuàng)傷弧菌是一種生活在海洋中，嗜溫嗜鹽的革蘭氏陰性菌，與霍亂弧菌、副溶血弧菌同屬弧菌屬[1]。1970年ROLAND[2]第一次報道了由創(chuàng)傷弧菌感染引起小腿壞疽和內(nèi)毒素性休克，1979年FARMER[3]將它命名為創(chuàng)傷弧菌。創(chuàng)傷弧菌具有機(jī)會致病性，在全世界各地都有感染報道[2，4-5]，隨著氣候變暖和海上作業(yè)活動的增加，以及具有感染高危因素如飲酒、肝臟疾病、血液系統(tǒng)疾病、糖尿病的人群增多，綜合導(dǎo)致創(chuàng)傷弧菌感染有增加的趨勢[6-7]。人感染創(chuàng)傷弧菌主要經(jīng)傷口以及誤食含菌的海產(chǎn)品，如生蠔、牡蠣等，而產(chǎn)生發(fā)熱、胃腸道反應(yīng)、蜂窩織炎和皮膚損害等癥狀，晚期出現(xiàn)膿毒癥和多器官功能障礙綜合征（multiple organ dysfunction syndrome，MODS）死亡率超過50%。在美國每年由食物引起的死亡病例中，創(chuàng)傷弧菌引起的死亡人數(shù)占95%[7-8]。因此，了解創(chuàng)傷弧菌的致病機(jī)制對于預(yù)防創(chuàng)傷弧菌感染以及治療都有重要意義。目前研究主要集中在宿主防御、細(xì)胞毒性、細(xì)菌運(yùn)動性、黏附相關(guān)蛋白等方面，近年來發(fā)現(xiàn)毒力調(diào)控和生物膜的形成在創(chuàng)傷弧菌致病中也發(fā)揮重要作用。

1 宿主防御

1.1 莢膜多糖（capsular polysaccharide，CPS）大量研究認(rèn)為CPS是創(chuàng)傷弧菌主要的致病因素之一[1，8]。CPS由創(chuàng)傷弧菌產(chǎn)生并分泌到細(xì)胞外，掩蓋細(xì)菌外部免疫原性結(jié)構(gòu)，不僅對抗補(bǔ)體系統(tǒng)的調(diào)理素作用和巨噬細(xì)胞的吞噬作用，幫助細(xì)菌逃避固有免疫監(jiān)視，還能決定細(xì)菌菌落形態(tài)，調(diào)控生物膜的形成[8]。一般認(rèn)為編碼CPS的基因是在生物膜成熟后開始表達(dá)的，來限制生物膜大小，而CPS的表達(dá)調(diào)控是由多種因素決定的，如rfaH基因、細(xì)菌的群體感應(yīng)（quorum sensing，QS）[9]。GARRETT等[10]研究發(fā)現(xiàn)創(chuàng)傷弧菌rfaH基因突變型幾乎不分泌CPS，在心浸液瓊脂（heart infusion，HI）培養(yǎng)基上表現(xiàn)出半透明表型，對機(jī)體的致病性也大幅度下降，易被機(jī)體清除，rfaH基因能夠調(diào)控CPS和血清抵抗，對細(xì)菌的毒力有重要影響。

1.2 酸中和 目前認(rèn)為，創(chuàng)傷弧菌在胃中低pH的環(huán)境下，可以通過兩個機(jī)制來抵抗胃酸，達(dá)到酸中和目的[8]。首先，創(chuàng)傷弧菌能通過增加賴氨酸脫羧酶的表達(dá)，將賴氨酸轉(zhuǎn)化為尸胺，中和胃酸和清除氧自由基（reactive oxygen species，ROS）[11]。最近有研究[12]發(fā)現(xiàn)賴氨酸脫羧酶能夠影響生物膜的形成，賴氨酸的含量減少會使生物膜形成減少；其次，創(chuàng)傷弧菌的錳超氧化物歧化酶（manganese superoxide dismutase，MnSOD）表達(dá)上調(diào)，清除胞內(nèi)產(chǎn)生的過多的ROS，同時也可以達(dá)到酸中和的目的，從而增強(qiáng)細(xì)菌在胃酸中的生存能力，但具體的機(jī)制仍不清楚[13]。

2 鐵超載

機(jī)體血清鐵水平與機(jī)體感染創(chuàng)傷弧菌息息相關(guān)，在血清中鐵以游離鐵和結(jié)合鐵的形式存在，創(chuàng)傷弧菌通過多種鐵攝取系統(tǒng)在血液中獲得鐵，進(jìn)行生長增殖。目前許多動物實(shí)驗和臨床資料顯示機(jī)體血清鐵升高通過多種途徑增加創(chuàng)傷弧菌感染，具體機(jī)制仍不清楚[14]。最近研究發(fā)現(xiàn)鐵作為創(chuàng)傷弧菌生長發(fā)育機(jī)制的主要觸發(fā)因素，影響創(chuàng)傷弧菌整個生長過程[15]。在血中，鐵的濃度能夠影響創(chuàng)傷弧菌逃避固有免疫相關(guān)基因的表達(dá)，創(chuàng)傷弧菌主要的鐵攝取調(diào)節(jié)蛋白（ferric uptake regulator，F(xiàn)UR）可以直接或間接抑制一種QS主要調(diào)節(jié)因子（smcR基因）的轉(zhuǎn)錄從而影響整個鐵攝取過程，PAJUELO等[15]首次報道了弧菌中FUR抑制細(xì)菌代謝調(diào)節(jié)因子（crp）和編碼跨膜DNA連接調(diào)節(jié)蛋白（toxR）基因表達(dá)。鐵調(diào)素作為機(jī)體分泌的鐵負(fù)性調(diào)控激素，能夠與膜鐵轉(zhuǎn)運(yùn)蛋白1（ferroportin1，F(xiàn)PN1）結(jié)合，抑制后者活性，并促進(jìn)后者發(fā)生降解，間接調(diào)節(jié)鐵穩(wěn)態(tài)，當(dāng)疾病狀態(tài)下如血液系統(tǒng)疾病血色素沉著病，鐵調(diào)素表達(dá)下調(diào)，會引起血清鐵增多，機(jī)體更易被創(chuàng)傷弧菌感染[16-17]。綜上所述，細(xì)菌的鐵攝取系統(tǒng)的調(diào)控以及人體內(nèi)鐵水平調(diào)控如鐵相關(guān)蛋白鐵調(diào)素、鐵轉(zhuǎn)運(yùn)蛋白等將會成為今后研究的熱點(diǎn)。

3 細(xì)胞毒性

3.1 脂多糖（lipopolysaccharide，LPS） LPS在創(chuàng)傷弧菌感染機(jī)體形成內(nèi)毒素休克和膿毒癥占主要作用，也是創(chuàng)傷弧菌感染主要的致病因素之一[1，14]。LPS能夠通過影響體內(nèi)一氧化氮合酶（nitricoxide synthase，NOS）的活性來發(fā)揮作用[8]；作為細(xì)菌生物膜的組成部分，LPS能夠發(fā)揮黏附作用促進(jìn)生物膜的形成[18]。HORSEMAN等[14]研究發(fā)現(xiàn)在創(chuàng)傷弧菌動物模型上，低密度脂蛋白（low density lipoprotein，LDL）和雌激素具有抵抗LPS的作用，降低死亡率，這也在一定程度上解釋了創(chuàng)傷弧菌感染時出現(xiàn)的男性患者遠(yuǎn)多于女性的現(xiàn)象。

3.2 溶細(xì)胞素 溶細(xì)胞素是由vvhA基因編碼的分泌到胞外的外毒素，具有細(xì)胞毒性使細(xì)胞凋亡，并能破壞紅細(xì)胞使其向血中釋放鐵，然而具體在疾病中的作用仍不清楚[8]。有研究發(fā)現(xiàn)vvhA對于創(chuàng)傷弧菌的毒力并不是很大[19]，外源性膽固醇能夠使溶細(xì)胞素單體寡聚化，從而降低溶細(xì)胞素的活性。LEE等[20]研究發(fā)現(xiàn)，溶細(xì)胞素能夠通過PKCα和ERK/JNK-NF-κB途徑觸發(fā)腸道上皮細(xì)胞內(nèi)線粒體ROS的產(chǎn)生，進(jìn)而導(dǎo)致細(xì)胞的壞死和凋亡。SONG等[21]報道在人腸道上皮Caco-2細(xì)胞模型上，創(chuàng)傷弧菌rVvhA通過操縱脂筏介導(dǎo)的c-Src/NOX信號通路和ERK/eIF2α激活，增加自噬流和自噬相關(guān)蛋白（LC3）形成，從而增加自噬相關(guān)的細(xì)胞死亡，損傷絨毛，破壞腸道正常結(jié)構(gòu)，促進(jìn)創(chuàng)傷弧菌的生長增殖。

3.3 Rtx毒素A1（repeats-in-toxin A1，RtxA1）RtxA1能夠介導(dǎo)細(xì)胞死亡和組織壞死，通過多種途徑促進(jìn)創(chuàng)傷弧菌在血液中的生長增殖和侵入，是創(chuàng)傷弧菌主要的致病因素之一。在細(xì)菌與細(xì)胞接觸后，RtxA1基因的表達(dá)增加，發(fā)揮細(xì)胞毒性，破壞腸道上皮細(xì)胞和腸道微絨毛結(jié)構(gòu)，在感染的早期發(fā)揮重要作用[22]。KWAK等[23]研究發(fā)現(xiàn)rtxA1基因存在4個變異區(qū)域，而每個區(qū)域?qū)?yīng)不同的效應(yīng)區(qū)域，編碼毒性不一的毒素，rtxA1基因的重排變異會導(dǎo)致新的菌株出現(xiàn)，毒性不同。KUO等[24]發(fā)現(xiàn)創(chuàng)傷弧菌RtxA1能夠影響細(xì)胞外的鈣離子濃度，抑制細(xì)胞內(nèi)鈣離子外流，而細(xì)胞外鈣離子濃度對于血液中吞噬細(xì)胞發(fā)揮吞噬能力具有重要作用，從而增強(qiáng)了創(chuàng)傷弧菌在血液中的生存能力，避免細(xì)菌被吞噬消除。KIM等[25]研究發(fā)現(xiàn)一種多酚化合物白藜蘆醇能夠減少細(xì)菌的運(yùn)動和黏附，下調(diào)RtxA1的表達(dá)和轉(zhuǎn)錄，減少RtxA1的細(xì)胞毒性從而起到一個保護(hù)作用。

3.4 胞外蛋白酶（extracellular proteases，ECPase） 創(chuàng)傷弧菌能產(chǎn)生各種各樣的ECPase發(fā)揮細(xì)胞毒性的作用，其中包括金屬蛋白酶（metalloprotease）、軟骨素酶（chondroitinase，ChSase）、透明質(zhì)酸酶（hyaluronidase，HAase）等。最近研究發(fā)現(xiàn)，VvpE是創(chuàng)傷弧菌產(chǎn)生的主要的金屬蛋白酶，能夠?qū)е陆M織壞死、皮膚損害和機(jī)體血管通透性改變，提示可能激活了血管內(nèi)緩激肽的產(chǎn)生，提示緩激肽在創(chuàng)傷弧菌致病過程中發(fā)揮了一定的作用；另外能夠降解IV型膠原纖維，激活Caspase-3前體，觸發(fā)細(xì)胞凋亡[14]。當(dāng)然，也有研究發(fā)現(xiàn)，vvpE基因突變株與標(biāo)準(zhǔn)株相比，小鼠的死亡率并沒有下降，提示在創(chuàng)傷弧菌致病過程中VvpE可能并不是主要因素[26]。LEE等[27]研究發(fā)現(xiàn)VvpE能夠通過激活ROS依賴的PKCδ/ERK途徑，在粘蛋白分泌細(xì)胞HR29-MTX細(xì)胞上，刺激黏蛋白-2（mucin-2，Muc-2）基因啟動子的甲基化，從而抑制Muc-2的轉(zhuǎn)錄水平，而Muc-2由杯狀細(xì)胞產(chǎn)生，是腸道上皮屏障的重要組成成分，創(chuàng)傷弧菌通過VvpE的作用使腸道結(jié)構(gòu)完整性得到破化。VvpM是最近發(fā)現(xiàn)的一種金屬蛋白酶，具有蛋白水解能力，降解人體血管基膜，導(dǎo)致局部出血和皮膚壞死。有研究發(fā)現(xiàn)，VvpM能夠通過ERK-細(xì)胞色素C-Caspases-9/3通路誘導(dǎo)細(xì)胞凋亡[28]。創(chuàng)傷弧菌分泌的另一種蛋白酶VvpS，具有肽聚糖水解酶活性，細(xì)菌在不同時期通過多種調(diào)節(jié)機(jī)制如賴氨酸家族調(diào)節(jié)因子（LeuO）、QS因子（SmcR）和總體毒力因子（CRP），調(diào)控VvpS基因的轉(zhuǎn)錄水平，從而影響其表達(dá)水平[29]。

4 細(xì)菌運(yùn)動性

4.1 鞭毛 創(chuàng)傷弧菌具有1條鞭毛，由6個鞭毛基因（flaA、flaB、flaC、flaD、flaE、flaF）編碼，其中flaB、flaD和flaC占主要作用[30]。一般認(rèn)為，鞭毛與細(xì)菌的運(yùn)動性、黏附性、細(xì)胞毒性、生物膜形成和侵襲有關(guān)。有研究發(fā)現(xiàn)，創(chuàng)傷弧菌中的3種鐵攝取蛋白TonB系統(tǒng)（TonB1、TonB2、TonB3）的共同作用與細(xì)菌的致病性有關(guān)，且起到調(diào)控鞭毛蛋白表達(dá)的作用[31]。

4.2 菌毛 創(chuàng)傷弧菌菌毛由GANDER等[32]在1989年首次在電鏡下發(fā)現(xiàn)，創(chuàng)傷弧菌表達(dá)IV型菌毛，由一種PilA蛋白質(zhì)組成，另一種蛋白質(zhì)PilD對菌毛的表達(dá)也發(fā)揮重要作用，PilD是一種酶，具有核酸內(nèi)切酶和甲基轉(zhuǎn)移酶活性。一般認(rèn)為，菌毛與細(xì)菌的侵襲、黏附能力和致病性有關(guān)。有研究發(fā)現(xiàn)，在小鼠模型中，敲除細(xì)菌IV型菌毛蛋白基因pilA能夠減少生物膜的形成，降低黏附能力，細(xì)菌的毒性也會下降[33]。除此之外，創(chuàng)傷弧菌基因組還存在另外一種編碼菌毛蛋白的基因，類似于霍亂弧菌的血凝素基因，其在創(chuàng)傷弧菌發(fā)病機(jī)制中的作用仍未知[33]。

5 黏附相關(guān)蛋白

5.1 膜外蛋白U（outer membrane protein U，OmpU） OmpU是創(chuàng)傷弧菌主要的一種膜外蛋白，它能夠與哺乳動物細(xì)胞外基質(zhì)的主要成分纖連蛋白結(jié)合，與細(xì)菌黏附功能有關(guān)。研究報道，OmpU的突變株與纖連蛋白的黏附能力只有野生型的4%，與RGD三肽結(jié)合能力為野生型的5%，與人喉表皮樣癌細(xì)胞HEp-2細(xì)胞的粘連能力是野生型的7%，細(xì)胞毒性是野生型的39%，半數(shù)致死量與野生型相差十倍[34]。

5.2 膜結(jié)合脂蛋白A（immunogenic lipoprotein A，IlpA） 創(chuàng)傷弧菌除了分泌OmpU蛋白之外，還存在IlpA，起到一個黏附素、免疫原性的作用。研究發(fā)現(xiàn)，創(chuàng)傷弧菌ilpA基因突變株相比于野生株，黏附能力明顯下降，進(jìn)而使細(xì)胞毒性減弱[35]。最近報道顯示，IlpA能通過激活人單核細(xì)胞（THP-1）的Toll樣受體1/2，激活胞內(nèi)TLR1/TLR2、MyD88、MAPKs、NF-κB和AP-1途徑，觸發(fā)炎癥級聯(lián)反應(yīng)，釋放大量的炎癥因子，具有同樣作用的還有細(xì)菌的CPS和VvpE[36]。

6 毒力調(diào)控

6.1 QS QS現(xiàn)象在細(xì)菌中較常見，細(xì)菌能合成并釋放一種自誘導(dǎo)物質(zhì)（autoinducer，AI）來調(diào)控細(xì)菌的許多生物行為。在創(chuàng)傷弧菌中，CPS、菌毛的合成受到QS系統(tǒng)的調(diào)節(jié)[26，37-38]。SmcR作為AI-2信號，是細(xì)菌QS的主要調(diào)節(jié)因子，而SmcR是金屬蛋白酶基因vvpE轉(zhuǎn)錄的主要激活劑，同時SmcR能激活CPS相關(guān)基因的表達(dá)。最近研究發(fā)現(xiàn)SmcR能夠負(fù)性調(diào)節(jié)細(xì)菌生物膜的形成，對于創(chuàng)傷弧菌的侵襲和致病性具有重要意義，但其中具體機(jī)制尚不清楚[39]。

6.2 總體毒力調(diào)節(jié)因子 毒力調(diào)節(jié)因子cAMP-cAMP受體蛋白（cAMP-cAMP receptor protein，CRP）系統(tǒng)已被大量研究，CRP能夠結(jié)合在DNA上，影響基因的表達(dá)，包括溶細(xì)胞素、金屬蛋白酶和鐵攝取系統(tǒng)都受到CRP系統(tǒng)的調(diào)控。另一種毒力調(diào)節(jié)因子AphB具有廣泛的功能，具有包括酸中和、運(yùn)動性、黏附性和致病性，最近有研究[40]發(fā)現(xiàn)AphB還能誘導(dǎo)腸道上皮細(xì)胞產(chǎn)生細(xì)胞因子白介素-8（interleukin-8，IL-8）。有趣的是，也有研究發(fā)現(xiàn)一些毒性基因如vvhA、vvpE和rtxA1并不受AphB的調(diào)節(jié)[41]。

6.3 溶血素U（hemolysin，HlyU） HlyU是創(chuàng)傷弧菌毒性主要的調(diào)節(jié)因子，能夠調(diào)節(jié)rtxA1、vvhA和vvpE基因的表達(dá)，也被認(rèn)為是細(xì)菌潛在的共同毒力調(diào)節(jié)因子。研究報道，rtxA1基因的表達(dá)受到H-NS阻遏物的抑制，而HlyU可以結(jié)合在rtxA1啟動子的上游，發(fā)揮去阻遏作用，使H-NS蛋白與DNA解離，從而使rtxA1正常表達(dá)，對于細(xì)菌侵襲至關(guān)重要[22]。最近有研究發(fā)現(xiàn)HlyU的結(jié)合位點(diǎn)是一段17個bp的回文序列，通過影響DNA的轉(zhuǎn)錄和翻譯從而調(diào)控創(chuàng)傷弧菌的毒力和致病性[42]。

7 生物膜

細(xì)菌形成生物膜能夠?qū)顾幬锖退拗髅庖呦到y(tǒng)的作用，增加了細(xì)菌感染人的能力，是一種非常重要的生存策略。創(chuàng)傷弧菌生物膜的成分由CPS、胞外多糖（exopoly saccharides，EPS）和LPS等成分組成。生物膜的形成受到多種因素的影響，包括前文提到的CPS、鐵、LPS、菌毛、QS、HlyU等，其中LPS在生物膜的早期發(fā)揮重要作用，而CPS在生物膜成熟后產(chǎn)生，限制生物膜過度生長[9]。最近的研究發(fā)現(xiàn)，一種胞外基質(zhì)蛋白CabA在生物膜形成和維持結(jié)構(gòu)完整中發(fā)揮重要作用[43]。

8 其他致病因子

有研究發(fā)現(xiàn)，創(chuàng)傷弧菌能利用唾液酸（sialic acid，SA）作為碳源進(jìn)行生長繁殖，其中NanR蛋白發(fā)揮重要的作用，NanR蛋白是N-乙酰神經(jīng)氨糖酸基因的阻遏物，發(fā)揮調(diào)節(jié)唾液酸分解代謝的作用[44]。

9 展望

隨著氣候的變化和生活環(huán)境的改變，創(chuàng)傷弧菌這種機(jī)會致病菌的感染逐年增加。對于創(chuàng)傷弧菌的致病機(jī)制的研究能全面認(rèn)識創(chuàng)傷弧菌，對預(yù)防感染和治療非常重要。創(chuàng)傷弧菌的致病機(jī)制尚未闡明，利用基因測序和定量蛋白質(zhì)組學(xué)的方法，通過高通量篩選技術(shù)和生物信息學(xué)分析方法找到創(chuàng)傷弧菌的潛在致病基因和毒力因子將會是以后的研究方向。

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