楊寶明 ，蘇 艷 ，黃玉玲 ，李永平 ，張藝萍 ，桂 敏 ，王麗花

（1.云南省農(nóng)業(yè)科學(xué)院農(nóng)業(yè)環(huán)境資源研究所，云南 昆明 650205；2.云南省農(nóng)業(yè)科學(xué)院花卉研究所，農(nóng)業(yè)部花卉產(chǎn)品質(zhì)量監(jiān)督檢驗(yàn)測試中心（昆明），國家觀賞園藝工程技術(shù)研究中心，云南 昆明 650205）

八仙花（Hydrangea macrophylla）又名繡球花、紫陽花，為虎耳草科八仙花屬植物。花大而美，花序呈球形，開花時節(jié)，花團(tuán)錦簇，其花色能紅能藍(lán)，令人悅目怡神，是常見的盆栽觀賞花木，也是主要的鮮切花。八仙花原產(chǎn)我國四川和日本，在亞洲主要是日本盛產(chǎn)，主要作為家庭盆栽觀賞。其花色隨土壤pH的變化而變化，在花蕾期施用硫酸鋁可使花顏色形成藍(lán)色，施用石灰可使花保持粉紅色[1]。我國栽培八仙花的時間較早，在明、清時代建造的江南園林中就栽有八仙花，現(xiàn)代公園和風(fēng)景區(qū)都成片種植，已形成景觀[2-3]。八鮮花傳統(tǒng)的繁殖方法為扦插、分株和壓條等，繁殖速度慢，不能滿足市場對種苗的需求，而植物組培技術(shù)可在短時間內(nèi)建立無性繁殖體系，不受外界條件和季節(jié)影響，生長周期短，可控性強(qiáng)，可實(shí)現(xiàn)周年生產(chǎn)，能穩(wěn)定地為市場提供性狀穩(wěn)定、品質(zhì)統(tǒng)一的優(yōu)良種苗[4-9]。有關(guān)八仙花組織培養(yǎng)的研究報(bào)道較多，但大部分都以莖段[5-18]、莖尖[19]或葉片[20]為繁殖材料，而以葉柄作為外植體的研究報(bào)道[21]很少。

本試驗(yàn)以八仙花葉柄為繁殖材料，通過分析比較不同激素濃度配比對外植體愈傷組織誘導(dǎo)、分化以及植株再生的影響，以篩選適宜的愈傷組織誘導(dǎo)培養(yǎng)基、不定芽增殖培養(yǎng)基和生根培養(yǎng)基，旨在為八仙花的組織培養(yǎng)提供一種新的方法。

1 材料和方法

1.1 材料

取八仙花植物當(dāng)年生枝條上的中部和上部葉柄（包括葉片）作為外植體。

1.2 方法

1.2.1 外植體的滅菌 在自來水下將外植體沖冼干凈，用0.2%的高錳酸鉀溶液浸泡15 min，用自來水沖洗干凈，剪去葉片，留下葉柄。在超凈工作臺上先用75%的酒精浸泡20 s，再用0.1%的升汞滅菌12 min，然后用無菌水沖洗5～6次，最后用無菌濾紙吸干外植體表面水分。

1.2.2 愈傷組織的誘導(dǎo)培養(yǎng) 經(jīng)滅菌的葉柄，用手術(shù)刀切長為0.5 cm左右的小塊，接種于1～16號處理的培養(yǎng)基中，平放置于培養(yǎng)基表面，30 d后統(tǒng)計(jì)出愈率及生長情況，并進(jìn)行轉(zhuǎn)接。每個處理接種10瓶，每瓶接種1塊外植體，重復(fù)3次。

1.2.3 不定芽的分化培養(yǎng) 經(jīng)愈傷組織誘導(dǎo)培養(yǎng)獲得的愈傷組織，切割成0.5 cm×0.5 cm的方塊，接種于17～24號處理的培養(yǎng)基中，20 d后統(tǒng)計(jì)不定芽分化率、芽叢數(shù)量和生長情況。每個處理接種10瓶，每瓶接種1塊愈傷組織，重復(fù)3次。

1.2.4 增殖培養(yǎng) 經(jīng)不定芽誘導(dǎo)培養(yǎng)獲得的小苗或者芽叢，分割為含1～2個莖節(jié)的莖段或含有2～3個小芽的芽叢，轉(zhuǎn)接到25～28號處理的培養(yǎng)基中，15 d后統(tǒng)計(jì)芽增殖率及生長情況。每15 d為一個轉(zhuǎn)接周期。每處理接種5瓶，每瓶接種6個莖段或芽叢，重復(fù)3次。

1.2.5 生根培養(yǎng) 經(jīng)增殖培養(yǎng)獲得的小苗，切成高度為2～3 cm的植株，接種于29～33號處理的培養(yǎng)基中，15 d后統(tǒng)計(jì)生根情況。每處理接種5瓶，每瓶接種10株，重復(fù)3次。

1.2.6 培養(yǎng)條件 以上培養(yǎng)基均為MS，蔗糖30 g/L，瓊脂5.0 g/L，pH值為5.8～6.0，光照強(qiáng)度為1 600～2 000 lx，培養(yǎng)室溫度為（25±2）℃。

1.3 測定項(xiàng)目及方法

計(jì)算愈傷組織誘導(dǎo)率、不定芽分化率、芽增殖率和生根率。

愈傷組織誘導(dǎo)率＝產(chǎn)生愈傷組織的外植體數(shù)/接種外植體數(shù)×100%；不定芽分化率＝產(chǎn)生芽的愈傷組織塊數(shù)/接種愈傷組織塊數(shù)×100%；芽增殖率＝不定芽產(chǎn)生的數(shù)量/接種芽數(shù)×100%；生根率＝生根苗數(shù)/接種苗數(shù)×100%。

2 結(jié)果與分析

2.1 不同濃度細(xì)胞分裂素6-BA與不同濃度生長素NAA，2，4-D配比對不同部位葉柄愈傷組織誘導(dǎo)的影響

表1 不同濃度激素配比對愈傷組織誘導(dǎo)的影響

從表1可以看出，將上部和中部葉柄分別接種到1～16號培養(yǎng)基中，都能產(chǎn)生愈傷組織，且中部葉柄比上部葉柄愈傷組織誘導(dǎo)率高，誘導(dǎo)效果以14～16號處理較好，在16號培養(yǎng)基中愈傷組織出現(xiàn)最早、生長速度最快，誘導(dǎo)率最高，上部葉柄和中部葉柄的誘導(dǎo)率分別達(dá)56.6%和90%，但愈傷組織結(jié)構(gòu)疏松；其次為15號培養(yǎng)基，上部葉柄和中部葉柄的誘導(dǎo)率分別為56.6%和86.6%，愈傷組織結(jié)構(gòu)松緊適中。2，4-D的誘導(dǎo)效果要好于NAA，誘導(dǎo)效果隨2，4-D，NAA濃度的增加而增加，其中，在含有2，4-D的培養(yǎng)基中，葉柄接種15d左右切口開始膨大，20 d左右形成明顯的愈傷組織細(xì)胞團(tuán)（1 cm×1 cm）；含有NAA的培養(yǎng)基中，葉柄接種20 d左右切口才開始膨大，25 d左右才有愈傷組織形成，生長緩慢，30 d愈傷組織誘導(dǎo)情況如圖1所示。

2.2 不同濃度細(xì)胞分裂素6-BA與不同濃度生長素NAA配比對不定芽分化的影響

由表2可知，在愈傷組織不定芽的分化培養(yǎng)過程中，17～24號處理均能分化不定芽，但不同的處理對不定芽的分化、芽的數(shù)量和生長影響不同。隨著細(xì)胞分裂素6-BA和生長素NAA濃度的增加，不定芽的分化效果明顯增強(qiáng)。6-BA為1.5 mg/L，NAA為0.2 mg/L時，分化效果最好，分化率達(dá)到90%，芽粗壯、整齊、疏密適中；6-BA為2.0 mg/L，NAA為0.2 mg/L時，不定芽分化較早，但芽點(diǎn)密集、芽伸長不明顯、整齊性差，不利于下一步的增殖培養(yǎng)。因此，應(yīng)以23號處理為好，即MS＋6-BA 1.5 mg/L＋NAA0.2 mg/L。不定芽的增殖培養(yǎng)情況圖2所示。

表2 不同濃度6-BA與NAA配比對愈傷組織不定芽分化的影響

2.3 不同濃度6-BA與不同濃度NAA配比對增殖培養(yǎng)的影響

由表3可知，25～28號處理均能實(shí)現(xiàn)芽的增殖，平均增殖芽2.03～7.03個，其中，28號處理芽的增殖數(shù)量最高、芽點(diǎn)最多，但芽密集、纖弱；26，27號處理芽的數(shù)量較28號處理少，但芽粗壯、整齊、葉片開展，更有利于下一步的生根壯苗培養(yǎng)。因此26，27號處理更有利于芽的增殖培養(yǎng)。

表3 不同濃度6-BA與NAA配比對芽增殖的影響

2.4 NAA和IBA對生根的影響

從表4可以看出，接種在33號培養(yǎng)基上的小苗，生根效果最好，其生根率達(dá)90.66%，平均根數(shù)達(dá)6.45條；其次為31號培養(yǎng)基，生根率達(dá)89.33%，平均根數(shù)為5.61條（圖3為25 d生根培養(yǎng)，圖4為生根苗生長情況）。

表4 不同濃度激素處理對生根的影響

3 結(jié)論與討論

應(yīng)用組培快繁技術(shù)是獲得性狀統(tǒng)一、穩(wěn)定、優(yōu)質(zhì)的八仙花種苗最為有效的途徑之一。葉柄可以誘導(dǎo)出完整植株，當(dāng)以葉柄作外植體時，中部葉片葉柄的誘導(dǎo)效果明顯好于上部葉片葉柄。因?yàn)樯喜咳~片葉柄因組織幼嫩，在滅菌過程中，損傷大，容易造成部分組織死亡或褐化，影響了誘導(dǎo)效果。

本研究結(jié)果表明，在相同濃度的6-BA條件下，2，4-D，NAA 都能誘導(dǎo)出愈傷組織，2，4-D 對愈傷組織的誘導(dǎo)效果明顯好于NAA，其可提前5～10 d產(chǎn)生愈傷組織、愈傷組織生長速度快。但2，4-D濃度過高，易造成愈傷組織結(jié)構(gòu)疏松，不利于不定芽的誘導(dǎo)[4]。適宜愈傷組織誘導(dǎo)的最佳培養(yǎng)基為MS＋6-BA2.5 mg/L＋2，4-D0.2 mg/L。

本研究中，適合不定芽誘導(dǎo)的最佳培養(yǎng)基為MS＋6-BA 1.5 mg/L＋NAA 0.2 mg/L，誘導(dǎo)率為90%，誘導(dǎo)效果好，易形成不定芽。適合不定芽增殖的最佳培養(yǎng)基為MS＋6-BA2.0 mg/L＋NAA0.2 mg/L，平均增殖芽5.45個，芽粗壯、整齊、成苗高。適合生根的最佳培養(yǎng)基為MS＋I(xiàn)BA0.6 mg/L＋NAA0.4 mg/L，其次為MS＋NAA 0.8 mg/L。IBA和NAA組合使用的生根效果好于單用NAA的效果，根系粗細(xì)適中、柔軟，不易折斷；NAA單獨(dú)使用時，生根時間短，但根系粗而脆，出瓶時易折斷。

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