楊瑞娟 ，白建榮 ，李 銳 ，常利芳

（1.山西大學(xué)生物工程學(xué)院，山西 太原 030006；2.山西省農(nóng)業(yè)科學(xué)院作物科學(xué)研究所，山西 太原 030031）

啟動(dòng)子是位于基因的上游，能夠被RNA聚合酶特異性識(shí)別的一段DNA序列。它像“開(kāi)關(guān)”，控制基因表達(dá)的起始時(shí)間和程度。啟動(dòng)子組成包括核心啟動(dòng)子與上游啟動(dòng)子元件。核心啟動(dòng)子由轉(zhuǎn)錄起始位點(diǎn)、TATA框和5'UTR序列組成[1-2]。上游啟動(dòng)子元件包括CAAT框、GC框和一些組成型及特異型元件，這些元件結(jié)合相應(yīng)的蛋白因子能夠提高轉(zhuǎn)錄效率[3]。啟動(dòng)子按功能及作用方式可分為誘導(dǎo)型啟動(dòng)子、組織特異型啟動(dòng)子和組成型啟動(dòng)子[4]。但是某些條件下，一個(gè)啟動(dòng)子可能有2類啟動(dòng)子的特性[5]。

植物基因工程是將外源基因?qū)胧荏w細(xì)胞，使其與受體染色體整合，改變受體植物遺傳特性的一種方法。它不但可以克服物種間的生殖隔離，還可以大大加快植物育種進(jìn)程。外源基因的表達(dá)必須有啟動(dòng)子的驅(qū)動(dòng)。傳統(tǒng)的基因工程中使用的大多是組成型啟動(dòng)子，它在植物的整個(gè)生命周期中都高強(qiáng)度表達(dá)，導(dǎo)致基因產(chǎn)物過(guò)度累積以及隨之而來(lái)的代謝紊亂甚至植物死亡。誘導(dǎo)型啟動(dòng)子是在植物適應(yīng)環(huán)境和長(zhǎng)期進(jìn)化過(guò)程中形成的，能夠響應(yīng)特殊的生物、物理、化學(xué)信號(hào)，進(jìn)而提高特定基因轉(zhuǎn)錄水平，來(lái)適應(yīng)一定范圍內(nèi)環(huán)境變化的一類啟動(dòng)子。在沒(méi)有誘導(dǎo)因子存在的條件下，它控制的編碼基因不表達(dá)或本底表達(dá)，一旦環(huán)境中出現(xiàn)誘導(dǎo)因素，編碼基因表達(dá)迅速增加。按照響應(yīng)環(huán)境的不同可以分為生物脅迫誘導(dǎo)的啟動(dòng)子、物理脅迫誘導(dǎo)的啟動(dòng)子、化學(xué)脅迫誘導(dǎo)的啟動(dòng)子[6]。誘導(dǎo)型啟動(dòng)子不但可以避免目的基因的持續(xù)表達(dá)對(duì)植物能量的過(guò)度消耗，而且可以消除基因產(chǎn)物積累對(duì)植物本身造成的傷害，成為近年來(lái)植物基因工程的研究熱點(diǎn)。

筆者從生物、物理、化學(xué)3個(gè)誘導(dǎo)方面對(duì)抗逆相關(guān)誘導(dǎo)型啟動(dòng)子的研究進(jìn)行了綜述，以期為相關(guān)學(xué)者的研究提供依據(jù)。

1 生物脅迫誘導(dǎo)型啟動(dòng)子

植物在生長(zhǎng)發(fā)育過(guò)程中會(huì)受到病原微生物如病毒、細(xì)菌、真菌等的侵染以及害蟲(chóng)的吞食侵害，從而導(dǎo)致存活率下降。生物脅迫誘導(dǎo)型啟動(dòng)子是指在植物受到生物脅迫時(shí)可以激活保護(hù)蛋白基因并調(diào)控其相關(guān)表達(dá)，從而消除有害代謝產(chǎn)物對(duì)植物自身起到保護(hù)作用。目前相關(guān)研究已取得一定進(jìn)展（表1）。

表1 生物脅迫誘導(dǎo)型啟動(dòng)子

1.1 病原菌誘導(dǎo)型啟動(dòng)子

WRKYs轉(zhuǎn)錄因子在植物抗病反應(yīng)中起重要作用，PETITOT等[7]克隆了咖啡WRKY轉(zhuǎn)錄因子的同源基因啟動(dòng)子CaWRKY1a和CaW-RKY1b，發(fā)現(xiàn)真菌脅迫可以誘導(dǎo)該啟動(dòng)子。何康[8]通過(guò)研究水稻抗紋枯病基因OS2H16啟動(dòng)子POs2H16，確定AATCA片段能夠獨(dú)立響應(yīng)紋枯病菌誘導(dǎo)。牟少亮等[9]研究發(fā)現(xiàn)，OsERF96基因可應(yīng)答白葉枯病或稻瘟病病原菌的侵染，其啟動(dòng)子可以應(yīng)答病原菌侵染誘導(dǎo)。

1.2 害蟲(chóng)誘導(dǎo)型啟動(dòng)子

當(dāng)受到害蟲(chóng)吞食后植物體內(nèi)水楊酸（SA）劇增，促使相關(guān)基因表達(dá)。KUMAR等[22]將煙草病害蛋白啟動(dòng)子PR-1a嵌合CaMV35S導(dǎo)入棉花，發(fā)現(xiàn)昆蟲(chóng)吞食能夠驅(qū)動(dòng)cry1EC基因表達(dá)，同時(shí)噴施SA可以提高棉花的抗蟲(chóng)性。有研究發(fā)現(xiàn)，當(dāng)擬南芥根部有線蟲(chóng)寄生時(shí)，3種細(xì)菌防衛(wèi)素基因（Pdf2.1，Pdf2.2，Pdf2.3）被誘導(dǎo)表達(dá)。SIDDIQUE等[23]將Pdf2.1啟動(dòng)子與GUS基因融合轉(zhuǎn)入擬南芥之后用線蟲(chóng)感染，發(fā)現(xiàn)GUS基因在其根中特異性表達(dá)。關(guān)麗梅等[24]將從秈稻基因組中獲得的Os01g73940啟動(dòng)子片段BPHIP連接到帶有GUS報(bào)告基因的植物表達(dá)載體上，并轉(zhuǎn)入中花11。通過(guò)GUS組織化學(xué)染色和定量RT-PCR檢測(cè)證明，BPHIP是一個(gè)受褐飛虱和茉莉酸處理誘導(dǎo)上調(diào)的啟動(dòng)子。

2 物理脅迫誘導(dǎo)型啟動(dòng)子

物理脅迫誘導(dǎo)型啟動(dòng)子是指響應(yīng)光、極端溫度、干旱等逆境脅迫使植物適應(yīng)非正常光照、溫度和干旱等惡劣環(huán)境，維持生長(zhǎng)發(fā)育。這類啟動(dòng)子的研究開(kāi)始的較早，研究成果最多（表2）。

2.1 光誘導(dǎo)型啟動(dòng)子

光在植物生長(zhǎng)發(fā)育中起重要作用，如光合作用、光形態(tài)建成。常見(jiàn)的光誘導(dǎo)型啟動(dòng)子有cab啟動(dòng)子和rbcS基因啟動(dòng)子。一般光誘導(dǎo)啟動(dòng)子同時(shí)具有綠色組織特異性[5，25]。王旭靜等[25]研究發(fā)現(xiàn)，中棉Gacab啟動(dòng)子含有GT1元件I-box和G-box等光誘導(dǎo)元件并且具有光誘導(dǎo)性。習(xí)雨琳等[5]將A－tRBCS-1A啟動(dòng)子片段轉(zhuǎn)化擬南芥，分析不同光照條件下的表達(dá)模式，結(jié)果顯示，該啟動(dòng)子是光誘導(dǎo)型和組織特異型啟動(dòng)子。

2.2 溫度誘導(dǎo)型啟動(dòng)子

2.2.1 高溫誘導(dǎo)型啟動(dòng)子 高溫脅迫條件下植物體內(nèi)會(huì)大量合成如HSP70，HSP90和HSP100等熱激蛋白來(lái)減輕脅迫引起的傷害[26]，當(dāng)熱激元件HSE與熱激因子HSF相互作用才能激活熱激蛋白基因的轉(zhuǎn)錄活性。RR?NDL等[27]研究發(fā)現(xiàn)，大豆Gmhsp17.32B啟動(dòng)子具有一段熱誘導(dǎo)因子（HSE）的同功序列。FREEMAN等[28]研究表明，大麥Hvhsp17基因啟動(dòng)子在高溫下能驅(qū)動(dòng)Hvhsp17基因在水稻中表達(dá)。

2.2.2 冷凍誘導(dǎo)型啟動(dòng)子 低溫條件下，植物體內(nèi)會(huì)發(fā)生如改變蛋白質(zhì)、碳水化合物組分或合成一些新的物質(zhì)等一系列生化反應(yīng)。冷響應(yīng)基因COR（cold-regulated）含有順式作用元件CRT和DRE[29]。BELINTANI等[30]研究發(fā)現(xiàn)，甘蔗ipt基因啟動(dòng)子ATCOR15a可使ipt基因在冷凍脅迫下表達(dá)量增加，減少冷凍引起植物的損傷。WANG等[31]分離了玉米中受低溫、干旱誘導(dǎo)顯著表達(dá)的蛋白激酶基因ZmCKS2的啟動(dòng)子，并對(duì)其進(jìn)行功能驗(yàn)證。結(jié)果表明，ZmCKS2啟動(dòng)子受干旱、低溫脅迫和不同激素（ABA，MeJA，SA）的多因素誘導(dǎo)，缺失啟動(dòng)子片段P2（367 bp）是受低溫、MeJA和SA誘導(dǎo)的最小的啟動(dòng)子片段。呂兆勇等[32]研究證明，葡萄PCAN啟動(dòng)子具有低溫和干旱脅迫下誘導(dǎo)表達(dá)的特性（表2）。

表2 物理脅迫誘導(dǎo)型啟動(dòng)子

2.3 干旱誘導(dǎo)型啟動(dòng)子

干旱條件下，植物根毛細(xì)胞感知水分脅迫信號(hào)并進(jìn)行信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)，誘導(dǎo)水分脅迫相關(guān)基因的表達(dá)。1992年YAMAGUCHI-SHINOZAKI等[53]首次從擬南芥中分離并且克隆出逆境誘導(dǎo)型啟動(dòng)子rd29。BIHMIDINE等[54]研究發(fā)現(xiàn)，rd29A，rd29B基因啟動(dòng)子在干旱條件下均被明顯激活，是抗旱型啟動(dòng)子。楊梅等[55]分離了干旱脅迫強(qiáng)烈誘導(dǎo)的水稻內(nèi)源基因Oshox24的啟動(dòng)子Oshox24P，并通過(guò)GUS活性檢測(cè)證明，該啟動(dòng)子是干旱誘導(dǎo)型啟動(dòng)子，可以調(diào)控目標(biāo)基因在水稻中的表達(dá)。

3 化學(xué)脅迫誘導(dǎo)型啟動(dòng)子

化學(xué)脅迫誘導(dǎo)型啟動(dòng)子是指在激素、高鹽、營(yíng)養(yǎng)元素缺乏和含量過(guò)高等逆境條件下使植物可以生長(zhǎng)的一類啟動(dòng)子。這類啟動(dòng)子的誘導(dǎo)因素受人類活動(dòng)影響較大，比如為了作物增產(chǎn)而過(guò)量施肥，導(dǎo)致土地鹽堿化和土壤板結(jié)，使農(nóng)作物受到新的脅迫，導(dǎo)致減產(chǎn)。與物理脅迫誘導(dǎo)型啟動(dòng)子相比，該類啟動(dòng)子研究較少（表3）。

表3 化學(xué)脅迫誘導(dǎo)型啟動(dòng)子

3.1 激素誘導(dǎo)型啟動(dòng)子

植物的生長(zhǎng)發(fā)育過(guò)程受激素的調(diào)節(jié)作用，但是激素不能直接作用于啟動(dòng)子序列，而是先與植物體內(nèi)受體結(jié)合，激活受體蛋白，然后再由作用于啟動(dòng)子中相應(yīng)激素應(yīng)答元件，驅(qū)動(dòng)下游基因的表達(dá)，從而引起一系列生理反應(yīng)[87]。XU等[70]分離了白松PsPR10啟動(dòng)子，并構(gòu)建融合報(bào)告基因載體轉(zhuǎn)入煙草，分別用 SA，ABA，JA，NaCl，甘露醇和 PEG-6000 處理轉(zhuǎn)基因植株，分別分析各種脅迫條件下GUS基因在根、莖、葉中的表達(dá)。結(jié)果表明，在所有脅迫條件下根的GUS活性均比對(duì)照組高，而莖和葉中GUS活性只在SA，ABA和JA條件下有增高。余建等[74]克隆了桑樹(shù)MnACO基因MnACO1啟動(dòng)子片段，對(duì)序列進(jìn)行分析發(fā)現(xiàn)，含有響應(yīng)赤霉素的GARE-motif和響應(yīng)植物激素的AuxRE元件。GUS活性分析表明，MnACO1為誘導(dǎo)型啟動(dòng)子兼具組成型啟動(dòng)子特性。

3.2 鹽誘導(dǎo)型啟動(dòng)子

最早被克隆并進(jìn)行功能分析的鹽誘導(dǎo)型啟動(dòng)子是擬南芥rd29A基因的啟動(dòng)子[53]。張新宇等[82]對(duì)經(jīng)300 mmol/LNaCl處理前后的轉(zhuǎn)AtPUB18基因啟動(dòng)子的擬南芥幼苗進(jìn)行組織化學(xué)染色，結(jié)果表明，處理后GUS基因的表達(dá)量明顯上調(diào)，說(shuō)明At－PUB18基因啟動(dòng)子是高鹽誘導(dǎo)型啟動(dòng)子。SUN等[83]研究發(fā)現(xiàn)，旱稻液泡膜質(zhì)子轉(zhuǎn)運(yùn)焦磷酸酶啟動(dòng)子TsVP1在高鹽誘導(dǎo)下有較強(qiáng)的活性。

3.3 營(yíng)養(yǎng)元素相關(guān)誘導(dǎo)型啟動(dòng)子

營(yíng)養(yǎng)元素在植物的生命活動(dòng)中起重要作用，是植物正常的生長(zhǎng)發(fā)育不可缺少的因素。在一定的濃度范圍內(nèi)，植物可以正常吸收外界環(huán)境中的營(yíng)養(yǎng)元素，然而當(dāng)環(huán)境中元素濃度不足或者過(guò)高，卻會(huì)對(duì)植物造成脅迫，影響植物生長(zhǎng)發(fā)育。

氮是植物蛋白質(zhì)、核酸和葉綠素的重要組成部分，氮素的含量直接影響葉片中葉綠素的含量，土壤中氮素缺乏會(huì)導(dǎo)致植物葉片黃化、根系量減少。劉生等[84]克隆了2個(gè)在大豆葉片或根系高豐度表達(dá)且響應(yīng)低氮脅迫的基因（RNDI和LNDI）的啟動(dòng)子，并分別融合GUS基因轉(zhuǎn)化擬南芥。GUS染色表明，2個(gè)基因的啟動(dòng)子都對(duì)低氮脅迫有響應(yīng)，在氮素脅迫環(huán)境條件下能夠調(diào)控組合的功能基因表達(dá)。銅是植物體多種酶類（細(xì)胞色素氧化酶、抗壞血酸氧化酶、多酚氧化酶等）的組成成分，還與光合作用有關(guān)。但植物正常生長(zhǎng)對(duì)銅需要少，土壤中銅含量由于污水灌溉和施用農(nóng)藥遠(yuǎn)遠(yuǎn)超過(guò)了植物所需，導(dǎo)致植物生長(zhǎng)受抑制甚至死亡。鐘活權(quán)[86]研究發(fā)現(xiàn)，擬南芥AtRD22啟動(dòng)子含有多個(gè)銅響應(yīng)元件CURECORECR，把該啟動(dòng)子與連接GUS報(bào)告基因轉(zhuǎn)化擬南芥后，發(fā)現(xiàn)高Cu2+脅迫條件下，AtRD22啟動(dòng)子能明顯誘導(dǎo)GUS基因在轉(zhuǎn)基因擬南芥莖和葉中表達(dá)。

4 小結(jié)與展望

誘導(dǎo)型啟動(dòng)子是僅在轉(zhuǎn)基因植物受到外界脅迫時(shí)驅(qū)動(dòng)外源基因表達(dá)的一種啟動(dòng)子，相比組成型啟動(dòng)子的表達(dá)模式，誘導(dǎo)型啟動(dòng)子可以節(jié)約植物體能量，減輕代謝負(fù)擔(dān)，在避免目的基因過(guò)量表達(dá)對(duì)植物的負(fù)面影響的同時(shí)提高植物抗逆性，具有重要的科研價(jià)值和商業(yè)價(jià)值。啟動(dòng)子主要通過(guò)順式作用元件來(lái)調(diào)控基因表達(dá)。一種啟動(dòng)子常常存在多種順式作用元件，這些元件以特殊組合方式調(diào)控相關(guān)抗逆基因的表達(dá)。目前脅迫誘導(dǎo)啟動(dòng)子研究主要集中在極端溫度、干旱和高鹽等方面，而關(guān)于營(yíng)養(yǎng)元素相關(guān)的誘導(dǎo)型啟動(dòng)子報(bào)道較少。

綜上所述，研究誘導(dǎo)型啟動(dòng)子作用方式和信號(hào)傳遞途徑之間聯(lián)系，可以為外源基因在轉(zhuǎn)基因植株精細(xì)調(diào)節(jié)提供理論依據(jù)。同時(shí)開(kāi)展誘導(dǎo)型啟動(dòng)子尤其是營(yíng)養(yǎng)元素相關(guān)的啟動(dòng)子研究，培育營(yíng)養(yǎng)元素高吸收利用和重金屬耐受性新品種。最終將相關(guān)研究結(jié)果大規(guī)模應(yīng)用于生產(chǎn)實(shí)踐，加速植物基因工程改良植物的進(jìn)程。

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