白俊峰 （北京市第十二中學(xué) 北京 100071）

進(jìn)行植物組織培養(yǎng)時(shí)，激素的種類與濃度對(duì)外植體形成愈傷組織和芽的誘導(dǎo)效果不同。正交實(shí)驗(yàn)設(shè)計(jì)是研究多因素、 多水平篩選的一種設(shè)計(jì)方法之一，它是根據(jù)正交性從全面實(shí)驗(yàn)中挑選部分有代表性的點(diǎn)進(jìn)行實(shí)驗(yàn)，這些點(diǎn)具備了“均勻分散，齊整可比”的特點(diǎn)，正交實(shí)驗(yàn)是一種高效、快速、經(jīng)濟(jì)的實(shí)驗(yàn)設(shè)計(jì)方法，可用較少的實(shí)驗(yàn)，找到最優(yōu)組合和趨勢(shì)最優(yōu)組合。以地被菊（Chrysanthemum morifolium Ramat）花序軸（圖1）為外植體，選取3 種常用的激素，它們分別是6-芐基嘌呤（6-BA）、萘乙酸（ NAA）、2,4-二氯苯氧乙酸（2,4-D）； 每種激素選取3 個(gè)濃度，其中1 水平為0濃度，2 水平為非洲菊的最適濃度，3 水平為非洲菊的最適濃度加倍（表1）。將三因素三水平正交表應(yīng)用到地被菊花序軸的不同激素濃度組合篩選中，具體實(shí)驗(yàn)設(shè)計(jì)如表2。

表1 激素種類濃度表

表2 三因素三水平正交實(shí)驗(yàn)設(shè)計(jì)表

1 材料與試劑

1）材料：地被菊幼花序，三角瓶，燒杯，酒精燈，剪刀等。

2）試劑：6-芐基嘌呤（6-BA），萘乙酸（NAA），2，4-二氯苯氧乙酸（2，4-D），70%乙醇，2%次氯酸鈉。

3）儀器設(shè)備：超凈工作臺(tái)，光照培養(yǎng)架，高壓滅菌鍋，鼓風(fēng)干燥箱。

2 過(guò)程與方法

2.1 準(zhǔn)備工作

1）消毒劑的配制。按比例配制2%次氯酸鈉和70%乙醇。

2）激素母液的配制。分別配制1 mg/L 的6-芐基嘌呤（6-BA）母液，1 mg/L 的萘乙酸（ NAA）母液，1 mg/L 的2，4-二氯苯氧乙酸（2，4-D）母液。

3）MS 培養(yǎng)基的配制與滅菌。按照說(shuō)明配制MS 培養(yǎng)基，并按照三因素三水平正交試驗(yàn)表添加激素，做好標(biāo)記；118°C 高壓滅菌18 min，備用。

4）器械包裝和滅菌。將要使用的器械用牛皮紙包裹，165°C 干熱滅菌2 h，備用。

2.2 外植體消毒和接種 將地被菊幼花序用流水沖洗20 min，再用70%的乙醇處理后，于超凈工作臺(tái)內(nèi)用無(wú)菌的鑷子剝離花序，取出花序軸（圖1），置于無(wú)菌錐形瓶?jī)?nèi)，先用70%的乙醇消毒30 s 后，用無(wú)菌水沖洗4 次，再用2%次氯酸鈉滅菌10 min，用無(wú)菌水沖洗4 次，備用；將已滅菌的花序軸置于無(wú)菌培養(yǎng)皿內(nèi)，吸干水分，用無(wú)菌鑷子和解剖刀切十字花，均分成4 份，接種至培養(yǎng)基內(nèi)。每瓶接種1個(gè)花序軸，每種培養(yǎng)基做6 個(gè)重復(fù)。

2.3 培養(yǎng) 將接種好的培養(yǎng)基置于無(wú)菌室內(nèi)，（20±2）°C 的條件下，每日光照12 h，連續(xù)培養(yǎng)。初始日期為2016年7月13日。

2.4 觀察記錄 定期觀察并記錄，按照標(biāo)準(zhǔn)進(jìn)行排序，根據(jù)愈傷的有無(wú)、愈傷的大小及高矮、愈傷的顏色對(duì)愈傷進(jìn)行排序和打分。愈傷的打分標(biāo)準(zhǔn)為：愈傷無(wú)為0 分，有愈傷的，按照愈傷的大小、高矮、愈傷的顏色進(jìn)行排序，排第一的為20 分，按照順序遞減2 分，分別為18、16、14、12、10、8、6、4、2；按照芽的有和無(wú)打分，無(wú)芽0 分，有芽的按照芽的高矮，芽的壯和弱，芽的多少進(jìn)行排序和打分，排序后，排第一的為20 分，按照順序遞減2分，分別為18、16、14、12、10、8、6、4、2，若在同一水平，無(wú)法區(qū)分則得分相同，下一排序分?jǐn)?shù)減4分，同時(shí)拍照。具體得分和分析見表3～表5，原始圖片見圖2、圖3。

3 結(jié)果與討論

3.1 實(shí)驗(yàn)最優(yōu)組合 實(shí)驗(yàn)組內(nèi)得分最高的組合為實(shí)驗(yàn)最優(yōu)組合。

3.1.1 愈傷的實(shí)驗(yàn)最優(yōu)組合 地被菊花序軸在接種后第18 天的時(shí)候，即7月31日可觀察到愈傷的組數(shù)為5、6、7、8、9 組，愈傷得分排序?yàn)?＞5＞8＞9＞7，在生長(zhǎng)1 周后,除了對(duì)照組沒有分化出愈傷,其他組都分化出了愈傷, 愈傷得分排序?yàn)?＞6＞9＞7=4＞5＞3＞2，其中8 組優(yōu)勢(shì)明顯（圖2），稱之為試驗(yàn)最優(yōu)組合（表3），8 組的激素濃度組合為A3B2C1，6-芐基嘌呤（6-BA）為3mg/L，萘乙酸（NAA）為0.2 mg/L，2，4-二氯苯氧乙酸（2，4-D）0 mg/L。

表3 花序軸原始得分記錄

3.1.2 芽的實(shí)驗(yàn)最優(yōu)組合 地被菊花序軸在接種第32 天時(shí)，即8月14日只有6 組和8 組有了芽的分化，6＞8，6 組稱之為芽的試驗(yàn)最優(yōu)組合（表5，圖3）。6 組的激素濃度組合A2B3C1，6-芐基嘌呤（6-BA）為1.5 mg/L，萘乙酸（NAA）為0.4 mg/L，2，4-二氯苯氧乙酸（2，4-D）0 mg/L。

3.2 趨勢(shì)最優(yōu)組合 每個(gè)單因素選項(xiàng)加分和最高的組合為趨勢(shì)最優(yōu)組合。

3.2.1 愈傷的趨勢(shì)最優(yōu)組合 表4為8月7日的愈傷分化情況，利用直觀分析的方法，根據(jù)數(shù)據(jù)分析，愈傷的趨勢(shì)最優(yōu)組合為A3B3C1，6-芐基嘌呤（6-BA）為3.0 mg/L，萘乙酸（NAA）為0.4 mg/L，2，4-二氯苯氧乙酸（2，4-D）0 mg/L。

表4 直觀分析地被菊花序軸第25 天愈傷

3.2.2 芽的趨勢(shì)最優(yōu)組合 利用直觀分析的方法,從表5看到8月14日的芽分化表，芽的趨勢(shì)最優(yōu)組合是A2B3C1，6-芐基嘌呤（6-BA）為1.5 mg/L，萘乙酸（NAA）為0.4 mg/L，2，4-二氯苯氧乙酸（2，4-D）0 mg/L，芽的試驗(yàn)最優(yōu)組合與趨勢(shì)最優(yōu)組合吻合。

表5 直觀分析地被菊花序軸第32 天芽

3.3 芽的誘導(dǎo)

1）直接誘芽，可選擇6 組培養(yǎng)基，直接培養(yǎng)45 d 即可誘導(dǎo)出芽，再用生根培養(yǎng)基，誘導(dǎo)出根就可煉苗和栽培，這有利于節(jié)約生長(zhǎng)時(shí)間和生長(zhǎng)空間，降低育苗成本，有一定商業(yè)價(jià)值。

2）觀察完整的組織培養(yǎng)的過(guò)程,可將8 組的愈傷培養(yǎng)至第18 d 時(shí),轉(zhuǎn)至誘芽培養(yǎng)基上進(jìn)行芽的誘導(dǎo),待芽長(zhǎng)成一定大小,轉(zhuǎn)至生根培養(yǎng)基上進(jìn)行根的誘導(dǎo),再依次進(jìn)行煉苗和栽培。

3.4 結(jié)論 愈傷組織誘導(dǎo)的激素濃度最優(yōu)組合為6-芐基嘌呤（6-BA）為3 mg/L，萘乙酸（NAA）為0.2 mg/L，2，4-二氯苯氧乙酸（2，4-D）0 mg/L；芽誘導(dǎo)的激素濃度組合為6-芐基嘌呤（6-BA）為1.5 mg/L，萘乙酸（NAA）為0.4 mg/L，2,4-二氯苯氧乙酸（2，4-D）0 mg/L。愈傷組織的趨勢(shì)最優(yōu)組合為6-芐基嘌呤（6-BA）為3.0 mg/L，萘乙酸（NAA）為0.4 mg/L，2，4-二氯苯氧乙酸（2，4-D）0 mg/L；芽的趨勢(shì)最優(yōu)組合為6-芐基嘌呤（6-BA）為1.5 mg/L，萘乙酸（NAA）為0.4 mg/L，2，4-二氯苯氧乙酸（2，4-D）0 mg/L。芽的實(shí)驗(yàn)最優(yōu)組合與趨勢(shì)最優(yōu)組合吻合。

3.5 進(jìn)一步實(shí)驗(yàn) 由于愈傷組織的實(shí)驗(yàn)最優(yōu)組合與趨勢(shì)最優(yōu)組合有一點(diǎn)偏差，需進(jìn)一步驗(yàn)證趨勢(shì)最優(yōu)組合，看是否優(yōu)于實(shí)驗(yàn)最優(yōu)組合；芽的趨勢(shì)最優(yōu)組合與實(shí)驗(yàn)最優(yōu)組合完全吻合，不需要驗(yàn)證。