胡勝男

摘要 從學(xué)生鐵皮石斛組織培養(yǎng)過(guò)程中，查閱資料時(shí)提出的疑問(wèn)出發(fā)，通過(guò)紙圓片抑菌實(shí)驗(yàn)和最小抑菌濃度實(shí)驗(yàn)驗(yàn)證鐵皮石斛的免疫藥用價(jià)值。結(jié)果表明，鐵皮石斛對(duì)金黃色葡萄球菌、大腸桿菌和綠色鏈球菌具有不同程度的抑制作用，對(duì)大腸桿菌的抑制效果最好。

關(guān)鍵詞 鐵皮石斛 抑菌實(shí)驗(yàn) 最小抑菌濃度 核心素養(yǎng)

中圖分類(lèi)號(hào) G633.91

文獻(xiàn)標(biāo)志碼 B

文件編號(hào)：1003-7586（2018）11-0034-02

1問(wèn)題的提出

鐵皮石斛是我國(guó)傳統(tǒng)的名貴中藥材，富含多糖、氨基酸、生物堿等活性成分，具有消炎祛熱，養(yǎng)陰生津，補(bǔ)益脾胃的功效。我校生命科學(xué)體驗(yàn)館植物組織培養(yǎng)室育有大量的鐵皮石斛苗，作為學(xué)生拓展課植物組織培養(yǎng)的材料。學(xué)生在撰寫(xiě)植物組培實(shí)驗(yàn)報(bào)告查找資料的過(guò)程中，發(fā)現(xiàn)了大量有關(guān)鐵皮石斛藥用價(jià)值的記載。在商業(yè)廣告宣傳盛行的社會(huì)環(huán)境下，學(xué)生提出質(zhì)疑：鐵皮石斛提高人體免疫力的功效有多少可信度？能否通過(guò)設(shè)計(jì)一些簡(jiǎn)單的實(shí)驗(yàn)進(jìn)行驗(yàn)證？在這些問(wèn)題的驅(qū)動(dòng)下，師生共同開(kāi)展了如下探究活動(dòng)。

2探究方案

2.1實(shí)驗(yàn)設(shè)計(jì)

高中生已經(jīng)具備了一定的人體免疫相關(guān)知識(shí)，了解了人體免疫的實(shí)質(zhì)就是機(jī)體抵御“異己”，保持內(nèi)環(huán)境平衡和穩(wěn)定的過(guò)程。這些“異己”中絕大多數(shù)是一些病原微生物。服用鐵皮石斛增強(qiáng)人體免疫力的作用途徑可能是，可以通過(guò)增加體內(nèi)免疫細(xì)胞如巨噬細(xì)胞、T＼B淋巴細(xì)胞、NK細(xì)胞的數(shù)量或?qū)乖淖R(shí)別能力達(dá)到免疫效果。另外，鐵皮石斛中的活性成分可能直接起到抑制病原微生物的作用，如同人工免疫過(guò)程中注射抗體型疫苗。學(xué)生已經(jīng)在拓展教材中學(xué)習(xí)了微生物的接種方法和抗生素抑菌現(xiàn)象的觀察，可以嘗試使用課本介紹的紙圓片法研究鐵皮石斛對(duì)不同微生物的抑制效果。因此，選擇的病原微生物有金黃色葡萄球菌、大腸桿菌和綠色鏈球菌，可能引發(fā)腸道、呼吸道或皮膚黏膜的感染。在實(shí)驗(yàn)室條件下，就不同濃度的鐵皮石斛勻漿液的抑菌效果及最小抑菌濃度開(kāi)展研究。

2.2培養(yǎng)基和菌種的準(zhǔn)備

培養(yǎng)基的配置：將5g牛肉膏，10g蛋白胨，5gNaCl，15g瓊脂混合于1000mL蒸餾水中，加熱煮沸至瓊脂完全溶解，調(diào)節(jié)pH在7.2-7.6，121℃高壓滅菌25min，待其冷卻后倒平板備用。

菌種活化和菌懸液的配置：分別挑取菌種在相應(yīng)的培養(yǎng)基上劃線(xiàn)，然后置于恒溫培養(yǎng)箱中培養(yǎng)（37℃，36h）。用接種環(huán)挑取少量活化后的菌種接入裝有無(wú)菌生理鹽水的試管內(nèi)，震蕩均勻，制成菌懸液，然后用無(wú)菌水進(jìn)行稀釋?zhuān)够罹鷶?shù)為107-108cfu/ml，備用。

2.3實(shí)驗(yàn)材料的預(yù)處理與操作方法

取鐵皮石斛100g，剪碎后用電動(dòng)勻漿器勻漿，裝入離心管離心后取上清液，通過(guò)細(xì)菌濾器后備用。用打孔器將濾紙加工成直徑為6mm的原形濾紙片，滅菌后分別在不同的鐵皮石斛勻漿液（質(zhì)量分?jǐn)?shù)分別為10%、20%、40%、80%）和無(wú)菌水中浸泡2h。用移液槍吸取200 uL菌液于培養(yǎng)基表面，涂布均勻，然后將紙圓片從浸泡的勻漿液或無(wú)菌水中取出、瀝干，等距離放置于培養(yǎng)基表面相應(yīng)位置，每個(gè)濃度取3次重復(fù)。將培養(yǎng)基放入培養(yǎng)箱內(nèi)倒置培養(yǎng)（37℃，24h）。待菌落長(zhǎng)出后，測(cè)定抑菌圈直徑并比較抑菌效果。

用兩倍稀釋法將鐵皮石斛勻漿液稀釋成質(zhì)量分?jǐn)?shù)分別為1.25%、2.5……、5%、10%…和20%的系列溶液。向制備好的培養(yǎng)基中分別加入不同濃度的稀釋液1mL，涂布均勻后置于培養(yǎng)箱中20min。取出后，再分別加200 uL菌液于培養(yǎng)基表面，涂布均勻，倒置于培養(yǎng)箱中，37℃培養(yǎng)24h。每個(gè)濃度重復(fù)3次，以不長(zhǎng)菌的最低濃度作為最小抑菌濃度。

3結(jié)果分析

不同濃度的鐵皮石斛勻漿液抑菌效果比較結(jié)果見(jiàn)表1。

鐵皮石斛勻漿液最小抑菌濃度比較結(jié)果見(jiàn)表2。

結(jié)果顯示，鐵皮石斛勻漿液對(duì)三種病原微生物具有不同程度的抑制效果，其中對(duì)大腸桿菌的抑制效果最強(qiáng)，對(duì)綠色鏈球菌的抑制效果最弱。最小抑菌濃度的測(cè)定結(jié)果顯示，鐵皮石斛勻漿液對(duì)金黃色葡萄球菌、大腸桿菌和綠色鏈球菌的最小抑菌濃度分別是5%、2.5%和10%，其結(jié)果與紙圓片抑菌實(shí)驗(yàn)的測(cè)定結(jié)果一致。這表明服用鐵皮石斛確實(shí)有抑制部分病原微生物、強(qiáng)化免疫力的作用，尤其對(duì)維持腸道健康有益。

在拓展課的總結(jié)與展望部分，學(xué)生提出了如下問(wèn)題：本實(shí)驗(yàn)中檢測(cè)的微生物類(lèi)型有限，不能說(shuō)明鐵皮石斛具有廣譜的抗菌功能，被檢微生物的類(lèi)型有待增加;鐵皮石斛中的抗菌的有效成分有待明確，有條件的情況下可以把多糖、生物堿和氨基酸類(lèi)物質(zhì)分離，分別進(jìn)行抑菌實(shí)驗(yàn)。后續(xù)研究中，可以嘗試將鐵皮石斛勻漿液添加到相應(yīng)免疫細(xì)胞的培養(yǎng)基中，觀察其對(duì)免疫細(xì)胞數(shù)量及活性的影響。從本案例中，可發(fā)現(xiàn)，高中生已經(jīng)具備質(zhì)疑、查閱資料、設(shè)計(jì)實(shí)施實(shí)驗(yàn)、思考與總結(jié)的能力，教師應(yīng)根據(jù)學(xué)生的發(fā)展特征與需求提供支持與條件，助力學(xué)生核心素養(yǎng)的發(fā)展。