潘輝龍 張國如 王晉 吳興源

[摘要] 目的 分析腫瘤遠處轉移相關蛋白（Ezrin mRNA）的結構，尋找并驗證DNAzymes作用的最佳靶點。 方法 利用RNAstructure與RNAdraw程序分析Ezrin mRNA結構，計算其一、二級結構，兩種程序同時計算出堿基未配對的單鏈成環(huán)區(qū)，且連續(xù)存在4個以上，則將其設為反義技術的靶區(qū)域，在此區(qū)域內設計DNAzymes的作用靶點，再依據最低自由能原則，運用計算機中的OligoWalk程序進行篩選，以此方式得到各反義技術的作用靶點，以實驗方法驗證預測結果。 結果 兩種軟件預測的共同的單鏈區(qū)共42個，其中完全匹配的單鏈區(qū)21個，編碼區(qū)具27個。AU1655、AU1751、AU1766、AU1789及GU2623位于連續(xù)未配對堿基超過10個的單鏈區(qū)，僅AU1655、AU1751、AU1766、AU1789符合要求。酶切反應結果顯示DNAzymes在AU1751位點能夠最為理想地切割Ezrin mRNA。結論 相對于傳統(tǒng)的單純依靠實驗來尋找靶點，核酸二級結構聯(lián)合熱動力學參數能夠更精確、快速地處理靶點的設計和選取問題。AU1751位點相對應的DNAzymes不易形成穩(wěn)定的自身雜合體，有利于DNAzymes結合RNA。

[關鍵詞] Ezrin;反義技術;靶點;DNAzymes;二級結構

[中圖分類號] R73 ? ? ? ? ?[文獻標識碼] A ? ? ? ? ?[文章編號] 1673-7210（2018）12（c）-0008-04

[Abstract] Objective To analyze the structure of distant metastasis associated protein （Ezrin mRNA） and find and verify the best target of DNAzymes. Methods RNAstructure and RNAdraw programs were used to analyze the structure of Ezrin mRNA and calculate its first or secondary structure. If RNAstructure and RNAdraw simultaneously calculate 4 or more unpaired single chain ring forming regions， the single chain ring forming region would be set as the target area of antisense technology for the design of the target of the DNAzymes. Then， according to the principle of minimum free energy， the OligoWalk program was used for screening， and the target of each antisense technology was screened by screening. The experimental method was used to verify the prediction results. Results There were 42 common single chain regions predicted by the two software， of which 21 were single matched， and 27 were coding regions. AU1655， AU1751， AU1766， AU1789 and GU2623 were located in the single chain region over 10 consecutive unpaired bases. Only AU1655， AU1751， AU1766 and AU1789 meet the requirements. The results of enzyme digestion showed that DNAzymes could cut Ezrin mRNA most ideally at AU1751 site. Conclusion Compared with the traditional experiment to find the target， the combined thermal dynamic parameters of the two stage structure of nucleic acid could deal with the design and selection of the target more accurately and quickly. The DNAzymes corresponding to the AU1751 locus is less likely to form stable self heterozygotes， which is beneficial to DNAzymes binding to RNA.

[Key words] Ezrin; Antisense technology; Target; DNAzymes; Secondary structure

Ezrin是一種細胞骨架蛋白，具有連接細胞膜與細胞骨架的功能，屬于ERM（Ezrin、Radixin、Moesin）蛋白家族，其作用在于維持細胞正常形態(tài)，在細胞一系列生理功能中扮演著重要的角色[1]。大量研究結果表明，Ezrin蛋白在多種惡性腫瘤中都呈現高表達狀態(tài)[2-5]，且與腫瘤的轉移有密切關聯(lián)[6-7]。因此，將Ezrin蛋白作為靶點進行靶向治療可能成為惡性腫瘤遠處轉移的一個新的治療路徑。反義技術建立在堿基互補的基礎上，能夠使RNA的分子與目的基因特異性結合，令mRNA被切割或降解，使其表達受到抑制[8]。但靶點可能被基因的二級結構所隱藏，因而限制了反義技術的應用。最常用的反義技術之一為DNAzymes，是一種人工合成的單鏈的小DNA分子，可以在特定位點對RNA分子進行切割，從而下調相關基因和蛋白的表達。本研究聯(lián)合核酸二級結構和熱動力學參數來綜合預測DNAzymes的作用位點，以探求一種合理的設計方式使反義技術能夠運用于Ezrin。

1 對象與方法

1.1 研究對象

自GenBank數據庫篩選出編碼為X51521.1的人類Ezrin蛋白mRNA全長序列，在其中獲取3044個堿基編碼Ezrin蛋白的基因。通過RNAstructure與RNAdraw程序分析Ezrin mRNA結構，分析計算其一、二級結構的相關信息。兩種程序同時計算出堿基未配對的單鏈成環(huán)區(qū)，且連續(xù)存在4個以上，則將其設為反義技術的靶區(qū)域，在此區(qū)域內設計DNAzymes的作用靶點，再依據最低自由能原則，運用計算機中的OligoWalk程序進行篩選，以此方式得到各反義技術的作用靶點，篩選結果為AU1655、AU1751、AU1766以及AU1789。

1.2 細胞培養(yǎng)及DNAzymes合成

人成骨肉瘤耐藥細胞系MG63/DOX（100萬細胞數）購買自上海酶研生物公司，將細胞置于DMEM培養(yǎng)液中，加入10%小牛血清，37℃培養(yǎng)使其貼壁生長，每隔6 h觀察1次，至細胞90%融合后，取出，嚴格按照說明書提取RNA。Trizol總RNA抽提試劑盒購自上海滬峰化工有限公司。DNAzymes委托上海生工公司合成。與RNA提取試劑盒提取總RNA后，用紫外分光光度儀測定濃度與質量，行逆轉錄生成cDNA，并以cDNA作為模板進行擴增。以Ezrin編碼區(qū)1761 bp作為底物進行擴增，將擴增后的產物再作為模板進行體外轉錄，并克隆入T-tailed載體中合成質粒并測序。根據篩選出的AU1655、AU1751、AU1766以及AU1789四個切割位點分別合成相應的DNAzymes。在體外，采用DNAzymes鑒定EzrincRNA的酶切反應與底物。

1.3 EzrinmRNA一、二級結構與熱動力學的分析及預測

用軟件RNAdraw和RNAstructure分析EzrinmRNA全長序列以及其一、二級結構，同時檢測Ezrin mRNA一級結構內堿基數量及含量、37℃時EzrinmRNA的二級結構[10]。將兩種軟件計算出RNA二級結構中共同的單鏈區(qū)，若在連續(xù)4個以上出現沒有配對的堿基區(qū)域，則將其設計作為DNAzymes的作用的靶點。用核酸熱動力學軟件OligoWalk對DNAzymes和EzrinmRNA作用位點結合后形成的雜合體進行熱穩(wěn)定性計算[11-12]。

2 結果

2.1 EzrinmRNA結構預測

兩種軟件預測的共同的單鏈區(qū)共42個，其中完全匹配的單鏈區(qū)21個，編碼區(qū)具有27個。42個單鏈區(qū)的18個AU和GU位點被挑選作為DNAzymes的作用位點，其中12個在編碼區(qū)。見表2。

2.2 EzrinmRNA切割位點的篩選

OligoWalk軟件被用于計算DNAzymes和EzrinmRNA作用位點結合后的熱穩(wěn)定性，18個AU或GU位點的GBreak-targ、Goverall、Goligo-oligo和Goligo-self，見表2。依據篩選標準，僅AU1655、AU1751、AU1766、AU1789符合要求。該4個位點與所在的Ezrin mRNA二級結構關系密切，且均集中位于A1654-A1797編碼區(qū)，見圖1，可見有效的DNAzymes作用位點相對集中在特定區(qū)域。

2.3 酶切反應結果

酶切反應結果顯示，在預期位點成功切割Ezrin全長mRNA的只有AU1751相對應的DNAzymes，經反應后可見，AU1751位點所剩的底物最少。且此位點相對應的DNAzymes，其△Goligo-oligo為0 kcal/mol，高于其他DNAzymes。

3 討論

導致惡性腫瘤患者的預后較差及患者死亡的主要因素是腫瘤的遠處轉移，Ezrin蛋白已被證實在骨肉瘤[13-14]等惡性腫瘤中扮演者重要角色。

反義技術作為基因治療的方式之一，近年來得到了較快的發(fā)展，其中最常見的為DNAzymes反義技術，其具有廣闊的應用前景。有研究[15]表明位點是否被隱藏，嚴重影響著反義技術的應用。雖然DNAzymes的位點被認為與其他反義技術相似，但目前尚缺乏直接的研究證據支持，因此，高效的選擇DNAzymes對于其靶基因的作用點具有重要的研究意義。

在影響反義技術效果的因素中，靶基因的二級結構起著至關重要的作用。鑒于RNA的潛在二級結構可能阻礙DNAzymes與靶基因結合的。反義分子與靶基因在二級結構最簡單的區(qū)域結合最為牢固，因此研究者選擇作用位點時，單鏈區(qū)比雙鏈區(qū)有更大的優(yōu)勢[16]，高活性的反義分子作用位點被認為存在于mRNA中未形成二級結構的區(qū)域內[17]，反義技術的作用位點是否因為二級結構而被隱藏，與靶基因的單鏈區(qū)密切相關。對兔β-globinmRNA進行研究的結果證實了單鏈區(qū)對作用位點是否可及具有具有決定作用[18]。有研究提出DNAzymes的切割位點至少應該存在連續(xù)4個以上未配對的堿基成環(huán)區(qū)[19]，超過10個堿基連續(xù)未配對區(qū)對于選擇反義分子作用位點是更為理想的區(qū)域。

由于mRNA存在二級結構，掩蓋了相當部分的DNAzymes作用位點，因此不能成功結合反義分子，難以發(fā)揮作用下調金銀的表達，因此本研究目的不僅在于篩選租用位點，還需要對其進行實驗驗證。通過軟件計算，本研究得到了4個作用位點，每個位點均在連續(xù)10個以上未成對堿基形成的環(huán)狀區(qū)，其中AU1751位點相應的DNAzymes能夠成功切割EzrinmRNA，得到的片段與預期相符合。

DNAzymes和底物相互作用后，形成雜合體的熱動力學也影響著eDNAzymes對EzrinmRNA的切割。雜合體的熱穩(wěn)定性不僅與RNA雜合區(qū)域結構有關，也與反義分子結構的熱穩(wěn)定性有關。本研究將Goverall（-25.0 kcal/mol）設定為為評估標準，用以評價DNAzymes和靶基因雜交熱穩(wěn)定性，最終選出的4個位點均集中位于A1654～A1797編碼區(qū)，可見有效的DNAzymes其作用位點傾向于在某一個特定的區(qū)域相對集中。酶切反應結果顯示，在預期位點成功切割Ezrin全長mRNA的只有AU1751相對應的DNAzymes，經反應后可見，AU1751位點所剩的底物最少，說明DNAzymes在AU1751位點能夠最為理想地切割Ezrin mRNA。且此位點相對應的DNAzymes，其△Goligo-oligo為0 kcal/mol，高于其他DNAzymes，可見另外三個位點的DNAzymes可能形成自身雜合體，且較為穩(wěn)定，不利于DNAzymes結合RNA。推測DNAzymes與靶基因雜交時，△Goligo-oligo可用于預測其熱動力學參數。

另外，盡管RNA二級結構在反義技術中起至關重要的作用，但核酸三級結構也可能影響RNA與蛋白質之間的作用，限制其預測價值，因此，多種方法預測作用位點有其必要性。本研究通過體外實驗進行了預測所得位點的驗證，但將其應用到腫瘤的治療中，還需要進一步進行體內實驗，以明確其應用前景。

綜上所述，應用計算機程序預測與篩選針對EzrinmRNA的DNAzymes作用位點，相對于單純實驗方式，更為精確與快速、高效，將實驗與計算機技術聯(lián)合在一起，聯(lián)合多學科進行研究，有利于更大限度發(fā)揮反義技術的靶向治療作用。

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（收稿日期：2018-06-05 ?本文編輯：任 ? 念）