張德勇

真核生物中可逆性蛋白磷酸化受蛋白激酶調(diào)控，作為分子調(diào)控中最基本的機制，包括腫瘤在內(nèi)的一系列病理的發(fā)生均因激酶依賴性調(diào)節(jié)通路異常而紊亂，故在腫瘤治療中蛋白激酶被認(rèn)為是重要的干預(yù)靶點之一[1-2]。文獻(xiàn)研究顯示約有500多種細(xì)胞內(nèi)蛋白激酶被發(fā)現(xiàn)，有一半以上的蛋白激酶已有針對性的小分子抑制劑被研發(fā)出來，且FDA已經(jīng)批準(zhǔn)其中的35種進(jìn)入臨床應(yīng)用，同時有超過500種目前正在接受臨床試驗[3]。作為高度保守的蘇氨酸、絲氨酸蛋白激酶，Polo樣激酶（polo-1ike kinase，PLK）在真核生物中廣泛存在,之所以以果蠅同系物Polo對PLKs進(jìn)行命名，主要是因為其首次在有絲分裂異常的果蠅突變體中被提出。隨著研究的逐漸深入，PLKs家族于哺乳類動物體內(nèi)共有5種亞型被發(fā)現(xiàn)，分別是PLK1～5，其主要在細(xì)胞有絲分裂周期及生長中發(fā)揮不可或缺的調(diào)控作用[4]（表1）。PLKs家族均表現(xiàn)為高度保守的功能與結(jié)構(gòu)，除PLK5外，其他亞型在N-端均有一個蘇氨酸、絲氨酸激酶結(jié)構(gòu)域（kinase domain，KD)[5]。同時位于C-端特征性結(jié)構(gòu)域 (poloboxdomain，PBD)，主要調(diào)節(jié)亞細(xì)胞動態(tài)定位及PLK激酶活性，除PLK4的PBD域僅有一個外，其他均含有2個[6]。磷酸肽可與PBD端序列進(jìn)行結(jié)合，從而對激酶域進(jìn)行直接作用以發(fā)揮調(diào)控PLK功能，包括亞細(xì)胞定位、底物結(jié)合及上游激酶的活化等[7]。故在細(xì)胞增殖和轉(zhuǎn)運過程中PBD均發(fā)揮著重要作用,同該區(qū)域結(jié)合發(fā)揮抑制PLK1活性的抑制劑為底物競爭性抑制劑。PLK1于多數(shù)腫瘤組織中表達(dá)均顯著上調(diào)，且參與細(xì)胞惡性生物學(xué)行為及腫瘤發(fā)生、發(fā)展，所有的證據(jù)均顯示PLK1在腫瘤的治療過程中可能是重要的干預(yù)靶點[8]。隨著臨床上對PLK1小分子抑制劑研究的深入，不斷有新的PLK1高效選擇性抑制劑被發(fā)現(xiàn)，以PLK1為靶點的腫瘤干預(yù)方案已成為腫瘤治療中的熱點。本文將對PLK1小分子抑制劑在腫瘤治療中的應(yīng)用現(xiàn)狀及抗腫瘤活性進(jìn)行綜述。

表1 P L K s部分功能及定位

1 腫瘤與P L K 1的聯(lián)系

在人類各部位腫瘤細(xì)胞中PLK1的表達(dá)均表現(xiàn)為異常升高，但在正常組織中呈低表達(dá)，故在腫瘤的診斷及預(yù)后中PLK1是重要的標(biāo)志分子[9]。人類腫瘤中p53抑癌基因是截至目前發(fā)現(xiàn)的與腫瘤密切相關(guān)且可防止細(xì)胞向癌細(xì)胞轉(zhuǎn)化的基因，可保證細(xì)胞遺傳穩(wěn)定性及正常凋亡[10]。p53蛋白在細(xì)胞染色體DNA損傷后可結(jié)合DNA相應(yīng)部位，從而激活DNA自我修復(fù)，并使細(xì)胞周期于G1期停滯，細(xì)胞周期于DNA修復(fù)結(jié)束繼續(xù)進(jìn)行，同時p53蛋白于損傷修復(fù)失敗后可啟動凋亡程序誘導(dǎo)細(xì)胞凋亡，以防止細(xì)胞出現(xiàn)惡變[11]。而p53在腫瘤細(xì)胞中由于PLK1的異常升高而導(dǎo)致磷酸化，其活性也被抑制，導(dǎo)致p53凋亡程序在癌變細(xì)胞無法正常啟動，使癌變的出現(xiàn)概率得到了極大提高。文獻(xiàn)報道顯示臨床預(yù)后與PLK1的水平呈正相關(guān)，腫瘤的轉(zhuǎn)移及腫瘤細(xì)胞的增殖在PLK1下調(diào)后得到抑制，而且正常細(xì)胞即使低表達(dá)PLK1也可存活[12]。目前PLK1小分子抑制劑的研究已在臨床上廣泛開展，其主要包括ATP競爭型或非ATP競爭型抑制劑，已有部分PLK1抑制劑已進(jìn)入一期或二期臨床試驗。

2 P L K 1小分子抑制劑活性及應(yīng)用現(xiàn)狀

2.1 二氫蝶啶酮類 德國Boehringer Ingelheimg公司研制的BI2536和BI6727是ATP競爭型抑制劑，作為高選擇性抑制劑，其較其他蛋白激酶（63種）選擇性高出千倍以上，細(xì)胞有絲分裂中心體生成時BI2536可阻斷其周期正常運轉(zhuǎn)，引發(fā)細(xì)胞凋亡[13]。作為首個開始臨床研究的PLK1激酶抑制劑，BI2536對胰腺癌、小細(xì)胞肺癌等具有較好的抗腫瘤效果，目前其已完成臨床Ⅱ期實驗。BI6727也是ATP競爭型二氫蝶啶酮類激酶抑制劑，其PLK1的半抑制濃度（half maximal inhibitory concentration，IC50）值達(dá)到 0.87nM，對 PLK2 及 PLK3 在高濃度時也具有一定的抑制效果，PLK1的IC50值為5nM和56nM。經(jīng)過體內(nèi)研究表明，BI6727與BI2536相比具有體內(nèi)分布廣、半衰期及釋藥時間長等優(yōu)點。

2.2 嘧啶并二氮卓酮類化合物 TAK-960由瑞士羅氏公司研發(fā)，經(jīng)體外實驗證實其對乳腺癌、皮膚癌及乳腺癌等腫瘤細(xì)胞株均有明顯的抑制作用，對PLK1的IC50值為2nM左右，耐藥的優(yōu)勢顯著[14]。其作為可口服的高選擇性及高酶抑制活性的臨床前候選藥物，已開始進(jìn)行臨床Ⅰ期研究。二氫蝶啶酮類化合物與TAK-960的關(guān)鍵構(gòu)效關(guān)系類似，酮羰基酰胺的NH與氧分別與Leu 59及Asp 194氨基酸殘基相互影響，鉸鏈區(qū)同嘧啶環(huán)可產(chǎn)生重要的氫鍵作用，TAK-960的重要基團(tuán)為甲基和環(huán)戊烷，其細(xì)胞毒及PLK1的抑制活性在引入雙氟取代后可顯著改善。

2.3 喹唑啉并吡唑類化合物 作為可口服的選擇性PLK1抑制劑，NMS-P937是由意大利Nerviano Medical Science公司研制，可對各類腫瘤細(xì)胞系及實體瘤表現(xiàn)出良好的抗增殖活性，其對PLK1的IC50值約2nM，同時對PLK2、3的選擇性接近5000倍，是一類有效的選擇性抑制劑，其目前正接受臨床Ⅰ期實驗。目前已解析出其共晶復(fù)合圖（2YAC），PLK1鉸鏈區(qū)的Cys 133殘基與本化合物的氨基喹唑啉形成的氫鍵為活性必須，三氟甲氧基可提高化合物的選擇性，N-甲基哌嗪基則可提高水溶性，重要的可提高活性的氫鍵由酰胺部分與水媒介作用形成，目前其已開始臨床研究。

2.4 芐苯乙烯砜類化合物 作為芐苯乙烯砜類的重要代表，化合物ON01910是通過對α，β-不飽合砜類化合物進(jìn)行篩選及結(jié)構(gòu)優(yōu)化而得到，其本質(zhì)上是一類PLK1小分子非ATP競爭型抑制劑，其PLK1的IC50為9.10nM，并可結(jié)合酶的底物結(jié)合位點。其主要影響生物體細(xì)胞周期G/M期，而對激酶的抑制主要是通過與酶底物直接結(jié)合而發(fā)揮作用，使腫瘤細(xì)胞有絲分裂中紡錘體的生成被抑制，導(dǎo)致細(xì)胞周期停止，最終引發(fā)腫瘤細(xì)胞凋亡。此外肉瘤基因（sarcoma gene，Src）、PLK2、周期蛋白依賴性激酶-1（cyclin-dependent kinases1，CDK1）和Fyn的活性也可被ON01910抑制。研究通過臨床Ⅰ期實驗、動物實驗及體外實驗均表明ON01910同其他抗腫瘤藥物聯(lián)合用藥時可發(fā)揮較好的協(xié)同效果，ON01910對于腫瘤的作用效果目前已處于Ⅲ期臨床試驗階段，但ON01910的結(jié)合模式由于其結(jié)合位點比較特殊而仍不明確[15]。ON01910的底物結(jié)合區(qū)不易出現(xiàn)突變已被臨床研究證實，故可推測其結(jié)合模式應(yīng)該是可以預(yù)測的，且其對腫瘤細(xì)胞出現(xiàn)耐藥性的可能性較低。

2.5 噻吩類化合物 GSK46136作為ATP競爭型的PLK1選擇性抑制劑，是英國葛蘭素史克公司研制的噻吩類化合物，其PLK1的IC50值達(dá)到2nM。GSK461364對細(xì)胞分裂的作用隨著其濃度的變化而改變，在濃度＞300nM時，可使細(xì)胞周期G2期延遲；若濃度≤300nM時，可使細(xì)胞分裂停止于有絲分裂M期。目前GSK461364已經(jīng)開始臨床Ⅱ期研究。

2.6 N雜均二苯乙烯類化合物 HMN-214是HMN-176的前藥，作為N雜均二苯乙烯類化合物的重要一員，HMN-214通過在HMN-176中加入乙?；鶑亩笻MN-176的吸收性能得到顯著改善，HMN-214進(jìn)入體內(nèi)后可立即轉(zhuǎn)化為HMN-176。HMN-176可抗多種癌細(xì)胞株，如DU-145、PC-3等細(xì)胞株的IC50值可在100nM左右。其通過影響PLK1在細(xì)胞內(nèi)定位及分布，導(dǎo)致有絲分裂停滯于G2/M期，使紡錘體極體遭到破壞從而促進(jìn)腫瘤細(xì)胞凋亡，但HMN-214對PLK1并無直接的抑制作用，且該類化合物作用機制還需進(jìn)一步探索。目前其已開始臨床Ⅱ期研究。

2.7 Ⅱ型抑制劑 文獻(xiàn)報道顯示激酶的ATP口袋中活化環(huán)的打開或關(guān)閉與激酶是否被活化密切相關(guān)，ATP口袋在激酶非活化狀態(tài)時可形成一個新的疏水口袋，Ⅱ型抑制劑即為此時與該結(jié)合位點結(jié)合的[16]?；衔颯BE-13由同源建模構(gòu)建的PLK1的非活性構(gòu)象篩選得到，對PLK1的IC50值為0.2nM，其對家族內(nèi)部的PLK2與PLK3均具有較高選擇性。SBE-13能夠降低Hela細(xì)胞等各種癌細(xì)胞株細(xì)胞增殖，并引發(fā)細(xì)胞凋亡，但該類此化合物仍無明確的結(jié)合模式。

2.8 小分子天然產(chǎn)物的篩選和結(jié)構(gòu)改造 目前先導(dǎo)化合物的探索主要通過高通量篩選法，而采用此法的全球范圍內(nèi)多個研究團(tuán)隊對靶向作用于PBD的小分子天然產(chǎn)物的研究取得了一系列可喜的成果，同時深入探索了該類化合物的相關(guān)作用機制[17]。

提取自埃及黑種草中的天然產(chǎn)物百里醌（圖1a）不僅具有抗糖尿病、抗炎、抗氧化等作用，還有抗腫瘤等效果，其各類功效均已被大量文獻(xiàn)報道所證實[18]。百里醌可有效抑制多類腫瘤細(xì)胞系的生長，對腫瘤細(xì)胞有較好的特異性，可其對腫瘤細(xì)胞干預(yù)的相關(guān)機制及分子靶點仍需要進(jìn)一步的探索，但已經(jīng)有文獻(xiàn)研究表明其干預(yù)靶點可能為PLK1的PBD?，F(xiàn)階段相關(guān)研究顯示PBD與該磷酸化基團(tuán)結(jié)合可被百里醌阻斷，使PLK1的亞細(xì)胞無法正常定位，進(jìn)而阻滯細(xì)胞周期于G2/M期，最終引發(fā)腫瘤細(xì)胞凋亡[19]。其對PDB的IC50約為1μmmol/L，但百里醌對PLK1的選擇性不佳。Poloxin（圖1b）的關(guān)鍵結(jié)構(gòu)與百里醌類似，其主要通過用高通量篩選方案和熒光偏振技術(shù)篩選出的可結(jié)合PBD的小分子化合物。Poloxin與PBD發(fā)生結(jié)合，以使PLK1同底物間互相影響，最終發(fā)揮抑制PLK1的作用，其對PDB的IC50約為4.8μmmol/L，對PLK1的選擇性Poloxin顯著優(yōu)于百里醌。兩者均可與PBD結(jié)合從而導(dǎo)致染色體聚集異常和PLK1錯誤定位，最終使腫瘤細(xì)胞因有絲分裂受阻而凋亡。Poloxin對中心體的嚴(yán)重影響是其抑制腫瘤細(xì)胞的重要特征。宋云龍課題組的研究成果顯示Poloxin和百里醌均能結(jié)合PBD中底物的磷酸基結(jié)合位點，且兩者同磷酸基的結(jié)合位點氨基酸殘基是經(jīng)過π-cation來發(fā)揮相互作用[20]。

以苯并托酚酮為母核的紅倍酚（圖1c）提取自沒食子。國外研究通過高通量篩選對其化合物庫進(jìn)行篩選，結(jié)果顯示PLK1的PBD對底物的識別可被紅倍酚抑制，其還可使HeLa細(xì)胞的有絲分裂周期延長，使有絲分裂的起始延遲[21]。紅倍酚的IC50在0.3μmmol/L左右。有研究顯示馬兜鈴內(nèi)酰胺的衍生物Aristolactam AⅢa（圖1d）可對血小板聚集起到抑制效果，研究通過在HeLa細(xì)胞中顯微注射10μmmol/L的Aristolactam AⅢa，結(jié)果顯示細(xì)胞周期在G2/M期停滯，且全部細(xì)胞均在24h后與其發(fā)生結(jié)合，接著觀察HeLa細(xì)胞后發(fā)現(xiàn)與PLK1小分子抑制劑作用于細(xì)胞的效應(yīng)類似，大部分的細(xì)胞表現(xiàn)為無法重合的染色體和多極紡錘體[22]。Aristolactam AⅢa對多種腫瘤細(xì)胞系的抑制效果較好，IC50達(dá)到7～30μmmol/L，其對腺癌的抑制活性甚至超過長春瑞濱。同時Aristolactam AⅢa的其他衍生物均可抑制惡性上皮腫瘤及淋巴瘤等細(xì)胞，但其作用機制仍需進(jìn)一步探索。

2.9 含有磷酸化的絲氨酸/蘇氨酸的短肽及其衍生物目前多肽及多肽衍生物對PLK1的PBD作用的研究已經(jīng)取得了一定的成果。Yun等[23]的研究通過截取PLK1底物蛋白PBIP1中的磷酸肽，并截斷多肽的C端及N端，結(jié)果顯示磷酸化的五肽PLHSpT（圖1e）是最短的可與PLK1的PBD結(jié)構(gòu)域較好結(jié)合的多肽序列。蛋白結(jié)合能力可受到該類化合物多肽骨架及磷酸基的顯著影響，PLK1結(jié)合的選擇性則與其N端亮氨酸、脯氨酸殘基密切相關(guān)。通過對PLHSpT晶體結(jié)構(gòu)進(jìn)行研究后顯示，PLK1中的Lys540及His538的殘基可與磷酸基形成鹽橋，且PLK1中的多個肽鍵可與多肽骨架有氫鍵效應(yīng)。PLK1的Arg516胍基可與PLHSpT中脯氨酸羰基形成氫鍵，Arg516、Phe535于PLK1中組成的疏水性口袋可與脯氨酸中疏水性五元環(huán)結(jié)合。氨基酸Lys和Tyr在PLK2和PLK3中類似于PLK1中的Arg516和Phe535，嚴(yán)重影響脯氨酸的正常結(jié)合。故對PLK1 PLHSpT的選擇性較高。當(dāng)PLHSpT中組氨酸被丙氨酸取代后蛋白結(jié)合能力可受到明顯影響，即使研究顯示PLK1與組氨酸并無明確的相互作用。通過分析其晶體結(jié)構(gòu)可知，PLHSpT蛋白結(jié)合能力與其構(gòu)象密切相關(guān)，而絲氨酸中羰基可與組氨酸中咪唑環(huán)上NH形成分子內(nèi)氫鍵，PLHSpT構(gòu)象可受氫鍵有效控制。于脯氨酸的五元環(huán)或組氨酸的咪唑環(huán)上引入疏水性基團(tuán)或碳鏈可使PLK1與多肽的結(jié)合能力顯著提高。經(jīng)過對該類環(huán)狀肽的探索可為進(jìn)一步設(shè)計新型以PBD為靶點的小分子PLK1抑制劑提供重要的線索。

3 結(jié)語

腫瘤對人類的生命健康有著重要的影響，隨著環(huán)境及生活方式等發(fā)生重要變化，其發(fā)病率表現(xiàn)出逐年上升的趨勢，隨著臨床對PLK1研究的深入，以其為靶點對腫瘤進(jìn)行有效干預(yù)已成為熱點研究方向，而大部分的證據(jù)均顯示PLK1小分子抑制劑在抗腫瘤方面極具應(yīng)用前景。但該類藥物目前主要還停留在臨床試驗階段，且該類化合物的內(nèi)部選擇性仍需進(jìn)一步提高，而靶向藥物不良反應(yīng)與選擇性不佳密切相關(guān)，嚴(yán)重的不良反應(yīng)常常會給腫瘤患者帶來額外的傷害。同時PLK1小分子抑制劑在多數(shù)臨床實驗中給藥途徑通常是靜脈注射，使用存在極大的不便，故尋找具有可口服等良好理化性質(zhì)，對PLK1具有特異性及高效性的小分子抑制劑并使其安全有效地應(yīng)用于臨床是我們需要重點關(guān)注的問題。

圖1 作用于P B D的小分子天然產(chǎn)物

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