陳 敏 ，洪家麗 ，雷雅婷 ，陳嵐彬 ，陳永芳 ，萬旭志 ，龔世禹 ，劉藝琳 ，余曉丹 ，曾 峰 ， 劉 斌 ，3

（1.福建農林大學食品科學學院，福建福州 350002；2.國家菌草工程技術研究中心，福建福州 350002；3.福建農林大學生命科學學院，福建福州 350002）

真菌中含有豐富的生物活性物質，如真菌多糖、多肽、氨基酸、蛋白質、生物堿、萜類化合物、色素類化合物、甾醇，還有核苷類物質、酚、酯類、微量元素和維生素等[1]，是保健產品研究和開發(fā)的主要原料之一，其中金針菇以超高的保健價值和營養(yǎng)價值吸引人們的眼球。液體深層發(fā)酵是獲得食用菌菌絲體的主要方法，具有液體發(fā)酵周期短、工業(yè)化生產所需空間小、產量高等優(yōu)點[2]，比子實體的培植更適合工業(yè)化生產。研究發(fā)現(xiàn)，從液體發(fā)酵獲得金針菇菌絲體中提取的多糖有抗氧化[3-7]、提高免疫力[8-10]、抗腫瘤[5，11]等作用。在臨床試驗中，食藥用菌菌絲體多糖類活性物質無副作用[12]。菌絲體中的多糖含量也明顯高于子實體[13]，同時菌絲體多糖的抗氧化活性也大于子實體多糖[14]。目前，真菌液體發(fā)酵的研究主要集中于通過對培養(yǎng)基組成、培養(yǎng)條件的優(yōu)化來提高菌絲得率及其他代謝產物。果蔬汁中富含維生素、氨基酸和礦物質等，添加到培養(yǎng)基中作為氮和碳的補充來源，不僅有利于促進菌絲體生長，提高營養(yǎng)價值和改善風味，還能極大地降低成本，擴大工業(yè)生產。為了進一步提高菌絲體得率，應用響應面分析法，以金針菇菌絲生物量作為優(yōu)化響應值，通過葡萄糖、蛋白胨、KH2PO4和果蔬汁對液體發(fā)酵培養(yǎng)基進行優(yōu)化，以期為食用菌液體發(fā)酵果蔬汁提供理論依據(jù)和技術支持。

1 材料與方法

1.1 材料

1.1.1 菌種

金針菇菌株，福建農林大學國家菌草工程技術研究中心提供，每2個月傳代1次，于4℃條件下保藏。

1.1.2 儀器與設備

SW-CJ-2D型超凈工作臺，蘇州凈化設備有限公司產品；AL204型電子天平，梅特勒-托利多儀器有限公司產品；YXQ-LS-50SⅡ型立式壓力蒸汽滅菌器，上海博迅實業(yè)有限公司產品；101-3A型烘箱，廣州科域新材料科技有限公司產品；SKY-2102C型立式雙層低溫搖床，上海蘇坤實業(yè)有限公司產品；SHZ-D III型循環(huán)水真空泵，鞏義市予化儀器有限責任公司產品。

1.1.3 培養(yǎng)基

果蔬汁：胡蘿卜汁與梨汁比例為1∶1；金針菇液體發(fā)酵培養(yǎng)基：葡萄糖20 g/L，蛋白胨3 g/L，KH2PO43 g/L，MgSO4·7H2O 1 g/L，果蔬汁10%（V/V），pH值自然。

1.2 方法

1.2.1 液體菌種的制備

選取經過活化后的金針菇菌種制備液體菌種。在250 mL的三角瓶中裝入100 mL的液體培養(yǎng)基，使用一次性接種針勾取0.5 cm2大小的菌種接種于瓶中，重復操作接種5～6次，最后用脫脂棉塞封住三角瓶口，調整旋轉式搖床轉速為200 r/min，在25℃的條件下振蕩培養(yǎng)三角瓶7 d，備用。

1.2.2 培養(yǎng)基優(yōu)化

取第1步中振蕩培養(yǎng)完成的菌種作為一級菌種，使用一次性接種針接種于100 mL的液體培養(yǎng)基中，接種量10%，繼續(xù)在200 r/min旋轉式搖床上于25℃的條件下培養(yǎng)7 d，根據(jù)響應面分析法中Box-Behnken中心組合設計的原理，采用Design-Expert（Version 8.0.6.1）分析軟件設計進行四因素三水平的響應面分析試驗[15-16]。以菌絲體干質量為考查指標，確定各因素對菌絲體影響的顯著性和液體發(fā)酵培養(yǎng)基最佳條件。

金針菇液體發(fā)酵試驗因素水平及編碼見表1。

表1 金針菇液體發(fā)酵試驗因素水平及編碼/%

1.2.3 測定方法

菌絲生物量：取發(fā)酵液在4℃條件下以轉速10 000 r/min離心10min，收集沉淀物，去離子水洗滌3次，置于已稱質量的干凈培養(yǎng)皿上，于真空干燥箱中在60℃條件下烘干至恒質量，稱質量2次差距不超過0.2mg即為菌絲生物量[17]。

2 結果與分析

采用響應面分析法中Box-Behnken設計法，以深層發(fā)酵得到的菌絲生物量為指標，對金針菇菌絲體生長過程中液體果蔬培養(yǎng)基的各組分進行優(yōu)化研究。第4，8，9，11次試驗為中心點試驗，用于考查模型的誤差。其中，第21組菌絲生物量最少，為8.175 mg/mL；第 24組菌絲生物量最多，為21.335mg/mL。

響應面中心組合設計金針菇發(fā)酵試驗及結果見表2。

表2 響應面中心組合設計金針菇發(fā)酵試驗及結果

2.1 金針菇菌絲生物量方差分析結果

采用 Design-Expert（Version 8.0.6.1） 分析軟件對表2中金針菇菌絲生物量的各項數(shù)據(jù)進行多項式擬合回歸，建立四元二次響應面回歸模型：

金針菇發(fā)酵菌絲生物量方差分析結果見表3。

表3 金針菇發(fā)酵菌絲生物量方差分析結果

由表3可知，回歸項中p＜0.001，說明所選擇模型非常顯著。失擬項p=0.193 1＞0.05，說明失擬項差異并不顯著，表明該二次回歸模型能夠較顯著擬合葡萄糖、蛋白胨、KH2PO4和果蔬汁質量分數(shù)對菌絲生物量的影響，該模型可替代試驗真實點對試驗結果進行分析。其中，模型一次項蛋白胨和果蔬汁質量分數(shù)對菌絲生物量影響十分顯著，葡萄糖和KH2PO4質量分數(shù)對菌絲生物量影響顯著；模型二次項葡萄糖、蛋白胨、KH2PO4質量分數(shù)對菌絲生物量影響十分顯著，果蔬汁質量分數(shù)對菌絲生物量影響顯著。

2.2 金針菇菌絲生物量響應面分析結果

對葡萄糖（A）、蛋白胨（B）、KH2PO4（C）、果蔬汁（D）4個因素進行交互作用分析。

各因素對金針菇菌絲生物量影響三維響應曲面見圖1。

從圖1可以非常直觀地看出，各因素對響應值的影響，隨著葡萄糖、蛋白胨和果蔬汁質量分數(shù)的增加，金針菇菌絲生物量也在增加。葡萄糖（A）、蛋白胨（B）、KH2PO4（C）、果蔬汁（D） 4個因素之間兩兩相互作用等高線均為橢圓，說明這4個因素兩兩之間交互作用明顯。

圖1 各因素對金針菇菌絲生物量影響三維響應曲面

2.3 驗證試驗

金針菇深層液體發(fā)酵試驗中，最優(yōu)培養(yǎng)基質量分數(shù)為葡萄糖2.15%，蛋白胨0.38%，KH2PO40.27%，果蔬汁12.90%；在此條件下，優(yōu)化后的培養(yǎng)基中菌絲體實際含量為21.46mg/mL，與預測值21.51mg/mL相近，說明預測值和實際值有較高的擬合性，工藝參數(shù)準確可靠。

3 結論

深層液體發(fā)酵是近年來生產食用菌菌絲體的主要方法之一，已經成為研究食用菌保健制品的重要手段，因此食用菌的開發(fā)利用已經由以往的大棚子實體栽培慢慢向深層發(fā)酵培養(yǎng)發(fā)展，為食藥用菌的研發(fā)帶來巨大利益和便利[18]。為了提高液體發(fā)酵金針菇菌絲體的得率，通常對液體發(fā)酵培養(yǎng)基進行優(yōu)化，目前食藥用菌液體深層發(fā)酵培養(yǎng)基提高菌絲體得率的優(yōu)化主要集中在氮源、碳源、無機鹽、溫度、pH值等方面[19-20]。試驗以葡萄糖作為碳源，蛋白胨作為氮源，對培養(yǎng)基進行優(yōu)化，同時添加經濟易得的果蔬汁來發(fā)酵食用菌，利用響應面優(yōu)化培養(yǎng)基配方以研究對菌絲體得率的影響。通過分析，得出最優(yōu)培養(yǎng)基配方為葡萄糖質量分數(shù)2.15%，蛋白胨質量分數(shù)0.38%，KH2PO4質量分數(shù)0.27%，果蔬汁質量分數(shù)12.9%。依據(jù)響應面分析調整培養(yǎng)基配方后實際測定值為21.46mg/mL，與預測值相近，說明預測值和實際值有較高的擬合性，工藝參數(shù)準確可靠。

通過對金針菇菌絲營養(yǎng)特性的研究可以明顯發(fā)現(xiàn)，速效性和遲效性的碳源或氮源，以及無機鹽和維生素等都會對菌絲生物量產生影響。國內在金針菇的液體發(fā)酵培養(yǎng)基中通常選擇添加黃豆粉、可溶性淀粉[21]等直接補充基礎的碳源和氮源。果蔬汁中富含單糖、礦物質和VC等均易被人體吸收[22]，可以在保證金針菇生長所需的碳源和氮源的同時進一步提供各類其他營養(yǎng)素，促進菌絲體的生長。同時，深層液體發(fā)酵后的果蔬汁培養(yǎng)基中富含氨基酸、多糖、無機酸等多種活性成分，不僅風味獨特，而且營養(yǎng)價值更高，可以后續(xù)開發(fā)利用，在批量化生產食用保健品中占有很大優(yōu)勢。

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