龐發(fā)虎，黃思良，趙晨晨

(1.南陽師范學(xué)院農(nóng)業(yè)工程學(xué)院，河南南陽 473061；2.南水北調(diào)中線水源區(qū)水安全河南省協(xié)調(diào)創(chuàng)新中心/河南省南水北調(diào)中線水源區(qū)生態(tài)安全重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室，河南南陽 473061)

內(nèi)生菌是指生活在健康的植物體內(nèi)，對植物沒有引起明顯病害癥狀的微生物。內(nèi)生菌在長期的適應(yīng)過程中與宿主植物協(xié)同進(jìn)化，建立了互惠和諧的共生關(guān)系，已成為國內(nèi)外研究的熱點(diǎn)[1]。內(nèi)生菌產(chǎn)生的代謝物質(zhì)能刺激植物的生長和發(fā)育，而植物能為內(nèi)生菌提供光合產(chǎn)物和礦物質(zhì)并通過種子幫助其傳播[2-3]。有關(guān)內(nèi)生菌影響宿主植物的光合作用已有一些報(bào)道，如Richardson等用內(nèi)生菌處理2種不同基因型的牛毛草后，發(fā)現(xiàn)其凈光合速率之間確實(shí)存在著差異[4]；沈德龍等研究發(fā)現(xiàn)用內(nèi)生成團(tuán)泛菌PantoeaagglomeransYS19接種水稻后可明顯提高水稻旗葉乳熟期的光合速率[5]。史應(yīng)武從甜菜根中分離出1株多黏類芽孢桿菌S7，用該菌接種甜菜后可使葉片的凈光合速率提高16.11%[6]。

目前對植物光合作用的研究多集中在非生物因素，而對于生物因子，尤其是植物內(nèi)生菌對宿主植物光合特征的影響研究較少。Larran等都對小麥的內(nèi)生菌進(jìn)行分離鑒定[7-9]，但有關(guān)小麥內(nèi)生細(xì)菌對小麥的光合特性及產(chǎn)量的影響，國內(nèi)外還鮮有報(bào)道。因此本研究用內(nèi)生假單胞菌JD204接種不同品種小麥后，分析內(nèi)生假單胞菌對小麥的生長及光合特性的影響，探討內(nèi)生假單胞菌影響光合參數(shù)的機(jī)制，揭示小麥內(nèi)生假單胞菌與產(chǎn)量的關(guān)系，以期為促進(jìn)小麥的生長和發(fā)育提供參考依據(jù)，為防病增產(chǎn)的新型生物有機(jī)肥料開發(fā)奠定基礎(chǔ)。

1 材料與方法

1.1 供試材料

1.1.1 供試品種 供試的14個小麥品種(新源958、豫農(nóng)416、豫麥130、金豐3號、矮優(yōu)66、豫麥69、中育12、高優(yōu)503、偃高006、鄭麥9023、開麥20、眾連1號、濮麥9號和矮抗噸產(chǎn)王)購自河南省南陽市種子公司。

1.1.2 供試菌株 菌株為小麥分蘗期分離自根部的1株內(nèi)生惡臭假單胞菌JD204，并對其進(jìn)行了抗藥性標(biāo)記，獲得抗藥性突變株JD204M，保存于南陽師范學(xué)院植物病理學(xué)實(shí)驗(yàn)室。

1.1.3 內(nèi)生假單胞菌懸浮液的制備 將抗藥突變株JD204M在NA平板上活化后，挑取2～3個環(huán)接種于NB培養(yǎng)基中，在160 r/min、30 ℃搖床上培養(yǎng)24 h，然后調(diào)菌體懸浮液濃度為107CFU/mL備用。

1.2 試驗(yàn)方法

1.2.1 試驗(yàn)設(shè)計(jì) 于2014年10月上旬用抗藥性變異株JD204M的菌體懸浮液(107CFU/mL)分別浸泡14個小麥品種種子，1 mL菌體懸浮液浸泡4 g小麥種子，浸泡24 h后分別播種于南陽國家農(nóng)業(yè)科技示范園區(qū)試驗(yàn)地(112°27′49″E、32°57′6″N)中，麥地常規(guī)深耕碎土，整理平整。施肥量為 750 kg/hm2復(fù)合肥(18% N，18% P2O5，9% K2O)。試驗(yàn)采用隨機(jī)區(qū)組設(shè)計(jì)，共28個處理，每處理重復(fù)3次，每處理面積為2 m×2 m(播種量80 g)，每個處理播種8行，以純NB培養(yǎng)液浸泡麥種為對照。

1.2.2 分蘗數(shù)的調(diào)查和株高的測定 在分蘗期對田間小麥分蘗數(shù)進(jìn)行調(diào)查，用直尺測量小麥株高。每小區(qū)采用5點(diǎn)調(diào)查法，每點(diǎn)調(diào)查20株，取其平均值。每個處理重復(fù)3次。

1.2.3 根系活力和葉綠素含量的測定 參照張志良等的方法[10]進(jìn)行。

1.2.4 光合參數(shù)的測定 2015年5月上旬，于晴天上午 09：00—11：00進(jìn)行測定。采用TPS-1便攜式光合儀，對JD204M處理區(qū)和對照區(qū)小麥光合參數(shù)凈光合速率(Pn)、氣孔導(dǎo)度(Gs)、胞間CO2濃度(Ci)和蒸騰速率(Tr)進(jìn)行測定[11]。每處理選擇長勢一致的小麥苗，每株測定葉齡相對一致的成熟頂生葉片，每個處理至少測定6次重復(fù)。

1.2.5 熒光參數(shù)的測定 采用Imaging-PAM熒光儀(Heinz Walz GmbH，Germany)于5月上旬晴天上午09：00—11：00進(jìn)行測定。選取生長良好的葉片暗適應(yīng)20 min后測定初始熒光(Fo)、最大熒光(Fm)；在光適應(yīng)(5 min)下測定Fm′、Fo′及Fs等熒光參數(shù)。根據(jù)測得的熒光參數(shù)計(jì)算：光系統(tǒng)Ⅱ最大光化學(xué)效率Fv/Fm=(Fm-Fo)/Fm；PSⅡ?qū)嶋H光化學(xué)效率：ΦPSⅡ=(Fm′-Fs)/Fm′。每個處理分別測定8次。

1.3 數(shù)據(jù)處理

采用Excel 2007進(jìn)行數(shù)據(jù)處理，用SPSS 17.0軟件進(jìn)行方差分析和多重比較(LSD法，α=0.05)。

2 結(jié)果與分析

2.1 JD204M對小麥分蘗數(shù)的影響

從表1可以看出，用內(nèi)生假單胞菌變異株JD204M處理小麥種子后能提高小麥植株的分蘗數(shù)。不同小麥品種提高幅度各異，其分蘗數(shù)雖高于各自的對照，但兩者之間差異不顯著。在14個品種中，鄭麥9023分蘗數(shù)增加最多，比對照提高34.15%，其次為豫農(nóng)416和矮優(yōu)66，分別比對照增加27.91%、27.27%；中育12內(nèi)生菌處理后與對照相比幾乎無變化。

表1 內(nèi)生細(xì)菌JD204M處理對小麥植株分蘗數(shù)、株高和根系活力的影響

注：同列數(shù)據(jù)后不同小寫字母表示在0.05水平上差異顯著。下表同。

2.2 JD204M對小麥株高的影響

試驗(yàn)結(jié)果(表1)表明，用內(nèi)生菌變異株JD204M處理后對不同品種小麥株高的影響各異。14個品種中，有12個(豫農(nóng)416、金豐3號、中育12、濮麥9號、鄭麥9023、開麥20、矮優(yōu)66、新源958、豫麥130、豫麥69、偃高006和矮抗噸產(chǎn)王)株高比對照增加了2.91%～40.58%(平均11.73%)，2個品種(眾連1號和高優(yōu)503)分別比對照降低2.60%和2.24%。矮優(yōu)66、濮麥9號、鄭麥9023、豫麥69和豫麥130小麥株高與各自的對照相比在0.05水平上達(dá)到顯著差異。

2.3 JD204M對小麥植株根系活力的影響

表1的結(jié)果顯示，JD204M對不同小麥植株根系活力的影響有差異。4個JD204M處理的小麥品種(濮麥9號、豫農(nóng)416、偃高006和豫麥130)植株的根系活力與各自對照相比差異顯著。12個小麥品種(矮優(yōu)66、高優(yōu)503、中育12、濮麥9號、鄭麥9023、開麥20、豫農(nóng)416、新源958、豫麥69、偃高006、豫麥130和眾連1號)的根系活力比對照增加4.18%～26.96%(平均13.81%)，金豐3號和矮抗噸產(chǎn)王根系活力分別比對照降低8.54%和7.58%。

2.4 JD204M對小麥葉片葉綠素含量的影響

由表2可以看出，用內(nèi)生菌變異株JD204M處理后有4個品種(中育12、金豐3號、豫麥69和眾連1號)小麥葉片的葉綠素a含量分別小于各自的對照，7個品種(中育12、新源958、偃高006、金豐3號、鄭麥9023、眾連1號、矮優(yōu)66)與對照之間具有顯著性差異；有3個品種(金豐3號、眾連1號、豫麥69)葉綠素b含量小于對照，8個品種(開麥20、新源958、偃高006、金豐3號、豫麥130、鄭麥9023、眾連1號和矮抗噸產(chǎn)王)與對照之間差異顯著；有4個品種(中育12、金豐3號、豫麥69和眾連1號)總的葉綠素含量小于對照，除了高優(yōu)503、開麥20、豫農(nóng)416外其余品種與對照之間都具有顯著性差異。10個品種小麥葉片總?cè)~綠素含量比對照增加3.24%～12.78%(平均7.64%)。

表2 JD204M對小麥植株葉片葉綠素含量的影響

2.5 JD204M對小麥葉片光合特性的影響

2.5.1 JD204M對小麥葉片凈光合速率(Pn)的影響 由表3可以看出，接種JD204M后有4個品種(中育12、金豐3號、豫麥69和眾連1號)的Pn與對照相比有所降低，其余10個品種(高優(yōu)503、新源958、偃高006、開麥20、豫麥130、豫農(nóng)416、鄭麥9023、濮麥9號、矮抗噸產(chǎn)王、矮優(yōu)66)的Pn與對照相比分別增加了20.69%、25.95%、22.82%、16.41%、20.51%、3.33%、14.01%、7.39%、9.20%和21.44%，表明內(nèi)生假單胞菌可以提高多個小麥品種的光合速率，增強(qiáng)光合活性，有利于葉片對光能的吸收。經(jīng)過統(tǒng)計(jì)分析，中育12、新源958、偃高006這3個品種與對照間具有顯著性差異。

2.5.2 JD204M對小麥葉片蒸騰速率(Tr)的影響 由表3可知，用JD204M處理后3個品種(中育12、豫麥69和眾連1號)小麥葉片的Tr小于對照，其余11個小麥品種葉片的Tr比對照增加0.41%～20.56%(平均10.74%)，2個品種(新源958和開麥20)小麥葉片的Tr與對照相比差異顯著，表明小麥接種內(nèi)生菌后能提高葉片的Tr。

2.5.3 JD204M對小麥葉片氣孔導(dǎo)度(Gs)的影響 試驗(yàn)結(jié)果(表3)表明，用JD204M處理后3個品種(中育12、豫麥69和眾連1號)小麥葉片的Gs小于對照，11個小麥品種葉片的Gs比對照增加3.63%～42.33%(平均20.79%)，5個品種(中育12、新源958、偃高006、豫麥130、豫農(nóng)416)接種內(nèi)生菌后葉片的Gs與對照相比具有顯著性差異，表明內(nèi)生菌可提高多個小麥品種葉片的Gs，有利于CO2氣體的交換和光合速率的增加。

2.5.4 JD204M對小麥葉片胞間CO2濃度(Ci)的影響 由表3可以看出，用JD204M處理后，中育12、金豐3號、豫農(nóng)416、豫麥69和眾連1號品種小麥葉片的Ci高于對照，其余9個品種(高優(yōu)503、新原958、偃高006、開麥20、豫麥130、鄭麥9023、濮麥9號、矮抗噸產(chǎn)王和矮優(yōu)66)葉片Ci分別比對照降低了9.16%、16.88%、15.31%、13.93%、20.78%、18.96%、8.96%、9.33%和8.71%；新源958、金豐3號、開麥20、豫麥130和鄭麥9023接種JD204M后Ci與對照間差異顯著。

2.6 JD204M對小麥葉片熒光特性的影響

2.6.1 JD204M對小麥葉片F(xiàn)v/Fm的影響Fv/Fm值一般是在葉片暗適應(yīng)20 min后測得，反映經(jīng)充分暗適應(yīng)小麥葉片PSⅡ的最大光化學(xué)效率，常作為度量植物葉片PSⅡ原初光能轉(zhuǎn)換效率及PSⅡ潛在活性的指標(biāo)[12]。由表4可以看出，用JD204M接種后，不同小麥品種間Fv/Fm值變化有所差異。除金豐3號、豫麥69和眾連1號外，其余小麥品種葉片的Fv/Fm值與對照相比均有所增加，但增加的幅度變化不大，且與對照間均無顯著性差異。

表3 JD204M對小麥植株光合特性的影響

2.6.2 JD204M對小麥實(shí)際光化學(xué)效率(ΦPSⅡ)的影響ΦPSⅡ是PSⅡ?qū)嶋H光化學(xué)效率，指光合電子傳遞的能量占吸收光能的比例，反映了在光照條件下PSⅡ反應(yīng)中心部分關(guān)閉的情況下的實(shí)際原初光能捕獲效率[13]。由表4可知，用JD204M處理后12個小麥品種(矮優(yōu)66、高優(yōu)503、中育12、濮麥9號、鄭麥9023、開麥20、豫農(nóng)416、新原958、矮抗噸產(chǎn)王、偃高006、豫麥130和眾連1號)的實(shí)際光化學(xué)效率(ΦPSⅡ)與對照相比均有所提高，其中矮抗噸產(chǎn)王和新原958小麥葉片實(shí)際光化學(xué)效率(ΦPSⅡ)分別比對照增加24.23%和22.20%，達(dá)到顯著差異，其余品種與對照間均無顯著性差異。

2.6.3 JD204M對小麥Fv/Fo的影響Fv/Fo值反映PSⅡ的潛在活性。由表4可以看出，用JD204M處理后3個品種(金豐3號、豫麥69和眾連1號)小麥葉片的Fv/Fo與對照相比降低，11個品種(中育12、高優(yōu)503、新原958、偃高006、開麥20、豫麥130、豫農(nóng)416、鄭麥9023、濮麥9號、矮抗噸產(chǎn)王和矮優(yōu)66)小麥葉片的Fv/Fo與對照相比分別增加了18.46%、10.63%、14.26%、21.83%、23.50%、18.68%、28.08%、3.79%、21.98%、27.50%和25.47%，但均無顯著性差異。

3 討論

葉綠素含量的高低與小麥產(chǎn)量密切相關(guān)。莫瑤等研究發(fā)現(xiàn)，接種固氮菌對4個不同甘蔗品種的葉綠素含量提高均有一定的促進(jìn)作用，且不同品種之間有差異[14-15]。用內(nèi)生細(xì)菌yc8接種后，不同油菜品種的葉綠素含量均有一定程度的提高[16]。本研究結(jié)果表明，用JD204M處理后，10個品種小麥葉片的葉綠素a含量高于對照，11個品種葉綠素b含量高于對照，10個品種總?cè)~綠素含量比對照增加 3.24%～12.78%(平均7.64%)。有研究認(rèn)為葉綠素a有利于吸收長波光，葉綠素b有利于吸收短波光，當(dāng)葉綠素a/葉綠素b值減少時，能提高葉片光合活性[17]。本研究得出凡是葉綠素a/葉綠素b值小于對照的品種，其小麥產(chǎn)量都高于對照，這與周竹青等研究認(rèn)為高產(chǎn)小麥品種的總?cè)~綠素含量維持在較高水平，葉綠素a/葉綠素b相對較低，說明該類型品種有較強(qiáng)的光能利用率的研究結(jié)果[18]相一致。但也有一些品種與趙昕等研究認(rèn)為接種AM真菌后，喜樹葉片葉綠素a/葉綠素b顯著高于無菌根幼苗的結(jié)果[19]相一致，這可能與不同的微生物對光合色素的化學(xué)特性影響以及不同植物對光強(qiáng)的響應(yīng)不同有關(guān)。

光合參數(shù)在一定程度上能很好地反映小麥的抗逆性程度。尤揚(yáng)等認(rèn)為胞間CO2濃度(Ci)與光合速率呈負(fù)相關(guān)[20]。王金龍等對黑麥草研究發(fā)現(xiàn)，內(nèi)生真菌的感染對其宿主植物的蒸騰速率、光合速率以及生物量都有顯著影響[21]。

表4 JD204M處理對小麥葉片熒光特性的影響

本研究結(jié)果表明，小麥在接種內(nèi)生假單胞菌JD204M后，不同品種小麥葉片的Pn、Ci、Gs和Tr與各自對照相比，其變化的趨勢和幅度有所差異，可能與參與這些光合參數(shù)調(diào)控的特定基因表達(dá)有關(guān)，具體的分子機(jī)理還待于進(jìn)一步研究。本試驗(yàn)研究也得出有10個小麥品種的Pn明顯高于對照，這可能是在光合作用過程中Ci、Gs和Tr等因子共同協(xié)調(diào)、相互作用的結(jié)果，這與吳凱朝等對甘蔗的研究結(jié)果[22]相一致。由于內(nèi)生假單胞菌JD204M在小麥體內(nèi)能夠很好定植，在小麥的生長發(fā)育過程中調(diào)控著小麥體內(nèi)的微環(huán)境，從而對小麥葉片表面氣孔的開閉和體內(nèi)水分與其他養(yǎng)分的運(yùn)輸起到調(diào)節(jié)作用，進(jìn)而影響著小麥的光合作用；另一方面由于該菌可以固氮和利用鐵銨鹽(數(shù)據(jù)未顯示)，為小麥的生長發(fā)育提供所需的氮素和鐵素營養(yǎng)，從而有利于光合作用的提高。本研究結(jié)果還表明，內(nèi)生假單胞菌JD204M對不同品種小麥間的光合生理效應(yīng)存在差異，這可能與內(nèi)生假單胞菌與小麥的基因互作和適應(yīng)性有關(guān)，具體原因還有待于進(jìn)一步探討和研究。

前人研究表明，F(xiàn)v/Fm、ΦPSⅡ、Fv/Fo等葉綠素?zé)晒鈪?shù)與光合作用的各個反應(yīng)過程密切相關(guān)，其特性極易受環(huán)境條件的變化而變化，能很好地反映植物的抗逆性程度，常用來作為測定植物葉片光合功能受逆程度的探針[23]。本試驗(yàn)結(jié)果表明，用內(nèi)生假單胞菌JD204M處理后，不同小麥品種的葉綠素?zé)晒鈪?shù)表現(xiàn)出差異，有11個品種的Fv/Fm和Fv/Fo、12個品種的ΦPSⅡ與對照相比有所增大，表明內(nèi)生菌處理后，小麥能很好地適應(yīng)光照度的變化，提高小麥葉片PSⅡ的實(shí)際光化學(xué)效率、電子傳遞速率，使小麥對光能的吸收和轉(zhuǎn)化效率提高，有利于光合作用的增強(qiáng)，這與史應(yīng)武對甜菜的研究結(jié)論[6]相一致。JD204M有固氮功能，推測可通過調(diào)節(jié)葉綠素?zé)晒鈪?shù)來提高小麥葉片的凈光合速率，進(jìn)而提高小麥產(chǎn)量。

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