王曉陽(yáng) 黃麗芳 閆林 周華 陳金煥 孫燕 董云萍

摘要 為分析我國(guó)咖啡種質(zhì)遺傳背景，提高咖啡資源保護(hù)與利用效率，利用31個(gè)SSR分子標(biāo)記對(duì)我國(guó)主要的92份咖啡種質(zhì)進(jìn)行遺傳多樣性檢測(cè)。結(jié)果表明.92份咖啡種質(zhì)遺傳相似系數(shù)變幅為0.666～0. 997，平均為0. 85，其中小粒種咖啡種內(nèi)平均遺傳相似系數(shù)為0.923。在遺傳多樣性分析基礎(chǔ)上，利用5個(gè)SSR標(biāo)記構(gòu)建了25個(gè)中粒種咖啡品系的DNA指紋圖譜。研究表明，我國(guó)咖啡種質(zhì)資源遺傳基礎(chǔ)非常狹窄，利用現(xiàn)有咖啡資源開(kāi)展品種選育潛力有限，應(yīng)加強(qiáng)對(duì)野生特異種質(zhì)的引種與發(fā)掘利用。

關(guān)鍵詞 咖啡;SSR;遺傳多樣性;指紋圖譜

咖啡與可可、茶同列世界三大飲料作物，在世界熱帶農(nóng)業(yè)經(jīng)濟(jì)、國(guó)際貿(mào)易及人們生活中占有重要地位。我國(guó)咖啡種植主要分布在云南、海南和四川等省，全國(guó)種植面積約3 000萬(wàn)hm²，總產(chǎn)量約12萬(wàn)t，是我國(guó)主要熱帶經(jīng)濟(jì)作物。

咖啡（Coffea Linn.）原產(chǎn)非洲埃塞俄比亞及剛果河流域，為茜草科咖啡屬植物，該屬包含大約100個(gè)種[1]，其中，具有商業(yè)栽培價(jià)值的主要為小粒種（C.arabica L.）和中粒種（C. canephora Pierre ex A.Froelzner），其余種類主要作為種質(zhì)資源和育種材料保存。我國(guó)咖啡資源主要來(lái)自于國(guó)外引種。目前，國(guó)內(nèi)收集保存咖啡種質(zhì)約700份，保存機(jī)構(gòu)主要為云南省德宏熱帶農(nóng)業(yè)科學(xué)研究所、中國(guó)熱帶農(nóng)業(yè)科學(xué)院香料飲料研究所、云南省農(nóng)業(yè)科學(xué)院熱帶亞熱帶經(jīng)濟(jì)作物研究所等科研單位（以下分別簡(jiǎn)稱德宏所、香飲所、熱經(jīng)所），另有少量由咖啡企業(yè)自行引進(jìn)保存，相當(dāng)一部分種質(zhì)存在重復(fù)保存。

我國(guó)咖啡種質(zhì)資源引種渠道多元，保存較為分散，種質(zhì)保存機(jī)構(gòu)間相互引種且獨(dú)立命名，難免存在種質(zhì)重復(fù)引進(jìn)、品種同種異名、異名同種，以及種質(zhì)間親緣關(guān)系不清等問(wèn)題，給咖啡育種親本選擇及優(yōu)良品種推廣應(yīng)用帶來(lái)不便。對(duì)我國(guó)現(xiàn)有咖啡資源開(kāi)展遺傳多樣性分析并進(jìn)行指紋圖譜構(gòu)建，對(duì)于我國(guó)咖啡核心種質(zhì)庫(kù)構(gòu)建、資源高效利用及品種推廣具有重要意義。

國(guó)內(nèi)相關(guān)學(xué)者利用形態(tài)學(xué)標(biāo)記開(kāi)展了咖啡種質(zhì)資源遺傳多樣性研究[2]，這種方法雖然簡(jiǎn)便、經(jīng)濟(jì)，但形態(tài)學(xué)標(biāo)記數(shù)量有限，且易受環(huán)境條件的影響.黃麗芳[3]、閆林[4]等利用RAPD、ISSR等分子標(biāo)記進(jìn)行了咖啡種質(zhì)資源遺傳多樣性分析及指紋圖譜構(gòu)建。RAPD、ISSR標(biāo)記為隨機(jī)性顯性標(biāo)記，結(jié)果可重復(fù)性有待提高。SSR分子標(biāo)記為特異性共顯性標(biāo)記，穩(wěn)定性好、結(jié)果可靠，非常適合遺傳多樣性分析及指紋圖譜構(gòu)建，現(xiàn)已廣泛應(yīng)用于水稻[5]、甘薯[6]、土豆[7]、大豆[8]、玉米[9]等許多作物的遺傳多樣性分析及指紋圖譜構(gòu)建。本研究利用SSR分子標(biāo)記對(duì)我國(guó)主要咖啡種質(zhì)資源進(jìn)行遺傳多樣性分析，并對(duì)我國(guó)現(xiàn)有中粒種咖啡品種進(jìn)行了DNA指紋譜圖構(gòu)建，為生產(chǎn)上品種真實(shí)性和純度鑒定、優(yōu)良品種推廣應(yīng)用提供技術(shù)支持，也為我國(guó)咖啡遺傳改良、育種親本選配、種質(zhì)保護(hù)、核心種質(zhì)庫(kù)構(gòu)建等提供科學(xué)依據(jù)。

1 材料與方法

1.1 材料

供試材料取自國(guó)內(nèi)三大咖啡種質(zhì)保存單位：德宏所、香飲所及熱經(jīng)所，共計(jì)92份，其中，小粒種59份、中粒種25份、大粒種8份（表1）。樣本包括我國(guó)咖啡主栽品種、國(guó)外引進(jìn)品種、自主選育品種及其它種質(zhì)，基本涵蓋了我國(guó)現(xiàn)有咖啡主要種質(zhì)。采集咖啡種質(zhì)葉片樣本，利用硅膠干燥劑干燥保存。

1.2 方法

1.2.1 DNA提取

利用植物DNA提取試劑盒（品牌：TIAhGEN，產(chǎn)品型號(hào)：DP320）進(jìn)行咖啡葉片樣本DNA提取。

1.2.2 SSR標(biāo)記檢測(cè)

SSR引物來(lái)自相關(guān)文獻(xiàn)發(fā)表的咖啡特異性SSR引物。PCR總反應(yīng)體系為20μL，組分包括：2 ng/μL基因組DNA， 1.5 mmol/L MgCl₂，0.2mmol dNTP，0.2μmol/L引物，0.03 U/μL Taq酶，1×PCR緩沖液。SSR-PCR擴(kuò)增反應(yīng)程序采用Touch-down PCR：94℃4min， 15個(gè)Touch-down循環(huán)（940C 15 s，600C 15 s，72℃ 30s，每次循環(huán)的退火溫度降0.7℃），15個(gè)普通循環(huán)（94℃ 15s，49.5℃ 15 s，72℃ 30 s），最后于72℃延伸20 min。擴(kuò)增產(chǎn)物于6%聚丙烯酰胺變性凝膠電泳分離檢測(cè)，銀染法顯帶分析。

1.2.3 數(shù)據(jù)統(tǒng)計(jì)及分析

統(tǒng)計(jì)SSR擴(kuò)增條帶，在相同位點(diǎn)上，有帶記為“1”，無(wú)帶記為“0”，利用Excel軟件建立數(shù)據(jù)矩陣。利用NTSYS-pc2.10y分析軟件通過(guò)加權(quán)平均法（UPMGA）計(jì)算遺傳相似系數(shù)并進(jìn)行聚類分析。篩選條帶清晰、多態(tài)性強(qiáng)的SSR引物用于指紋圖譜構(gòu)建。對(duì)SSR標(biāo)記擴(kuò)增條帶進(jìn)行圖形化處理;同一位點(diǎn)上有帶用黑色方格表示.無(wú)帶用白色方格表示，據(jù)此構(gòu)建咖啡品系DNA指紋圖譜。

2 結(jié)果與分析

2.1 多態(tài)性SSR引物篩選

通過(guò)相關(guān)文獻(xiàn)檢索.共獲取410對(duì)咖啡特異性SSR引物[10-16]。利用小粒種（CIFC7963 （F6）、TYPICA）、中粒種（越南-1、泰國(guó)4-2）、中小粒雜交種（ARABUSTA）及大粒種（南頂）共6份種質(zhì)對(duì)獲得的410對(duì)SSR引物進(jìn)行多態(tài)性篩選，共篩選出多態(tài)性SSR引物152對(duì)，從中繼續(xù)篩選出條帶清晰的多態(tài)性SSR引物31對(duì)（表2），用于后續(xù)遺傳多樣性分析及指紋圖譜構(gòu)建。

2.2 遺傳多樣性分析

利用篩選出的31對(duì)SSR引物對(duì)92份咖啡種質(zhì)進(jìn)行了擴(kuò)增檢測(cè)（部分引物檢測(cè)結(jié)果見(jiàn)圖1）。通過(guò)遺傳相似性分析，結(jié)果表明.92份咖啡種質(zhì)遺傳相似系數(shù)變幅為0. 666～0. 997 [‘CIFC7963 （F6）與‘德熱199-1相似系數(shù)為1，二者可能存在同種異名情況]，平均遺傳相似系數(shù)為0. 85，大粒種、中粒種種內(nèi)平均遺傳相似系數(shù)分別為0. 849、0.85，小粒種種內(nèi)平均遺傳相似系數(shù)高達(dá)0. 923，表明我國(guó)小粒種咖啡種質(zhì)資源遺傳基礎(chǔ)非常狹窄。進(jìn)一步分析小粒種、中粒種、大粒種咖啡種間遺傳相似系數(shù)，結(jié)果表明，種間平均遺傳相似系數(shù)為0.764，在遺傳相似系數(shù)分析基礎(chǔ)上進(jìn)行聚類分析，結(jié)果表明，在相似系數(shù)約0.8處可以大致將小粒種、中粒種、大粒種3個(gè)種分開(kāi)（圖2）。

2.3 指紋圖譜構(gòu)建

從31對(duì)SSR引物中篩選擴(kuò)增條帶清晰、穩(wěn)定且多態(tài)性好的引物，對(duì)25個(gè)中粒種咖啡品系進(jìn)行指紋圖譜構(gòu)建。結(jié)果表明，利用5對(duì)SSR引物（CMA41、CMA159、CM5、368、471，引物序列見(jiàn)表2）即可將25個(gè)中粒種咖啡品系完全區(qū)分開(kāi)。5對(duì)SSR引物在25個(gè)中粒種品系中共擴(kuò)增出20條清晰譜帶，每對(duì)引物平均4條，CMA41引物擴(kuò)增情況見(jiàn)圖1。通過(guò)對(duì)SSR擴(kuò)增條帶進(jìn)行圖形化處理，獲得了25個(gè)中粒種咖啡品系的SSR標(biāo)記指紋圖譜（圖3）。

3 討論

3.1 我國(guó)咖啡遺傳多樣性

本研究在國(guó)內(nèi)首次利用SSR分子標(biāo)記分析了我國(guó)咖啡種質(zhì)資源的遺傳多樣性。92份咖啡種質(zhì)平均遺傳相似系數(shù)為0.85，其中小粒種種內(nèi)平均相似系數(shù)高達(dá)0.923，表明我國(guó)咖啡種質(zhì)資源尤其是小粒種種質(zhì)資源遺傳基礎(chǔ)十分狹窄?？Х仍谖覈?guó)為外來(lái)引進(jìn)作物，在國(guó)內(nèi)無(wú)野生自然分布。我國(guó)現(xiàn)有咖啡種質(zhì)很大一部分是為滿足生產(chǎn)實(shí)際需求而引進(jìn)的育成品種。目前世界現(xiàn)有咖啡育成品種主要來(lái)自于Typica、Bourbon、Timor hybrid及其變種等少數(shù)親本材料，育成品種間遺傳多樣性十分狹窄，利用現(xiàn)有咖啡品種資源開(kāi)展優(yōu)良品種選育潛力十分有限?，F(xiàn)有咖啡育成品種的遺傳基礎(chǔ)僅占世界所有咖啡種質(zhì)資源遺傳基礎(chǔ)的很小一部分，加強(qiáng)對(duì)野生咖啡種質(zhì)資源優(yōu)異性狀的發(fā)掘與利用對(duì)于現(xiàn)有咖啡品種遺傳改良具有重要意義[17]。利用現(xiàn)有育成品種與野生特異性種質(zhì)雜交，進(jìn)而培育優(yōu)良雜交品種已逐漸成為咖啡品種選育的趨勢(shì)，目前，已培育出一系列具有高產(chǎn)、抗病、優(yōu)質(zhì)等優(yōu)良性狀的咖啡雜交新品種[18]。

3.2 咖啡分子標(biāo)記指紋圖譜構(gòu)建

中粒種和小粒種作為世界兩大咖啡商業(yè)栽培種，對(duì)其品種與種質(zhì)資源開(kāi)展指紋圖譜構(gòu)建具有重要意義。由于同屬但不同種，二者形態(tài)學(xué)差異較大，成年植株一般肉眼即可對(duì)所屬物種進(jìn)行辨認(rèn)區(qū)分.種子或幼苗也可利用種間特異性SSR標(biāo)記進(jìn)行快速鑒別[20]，因此，只需分別對(duì)二者進(jìn)行指紋圖譜構(gòu)建即可。

中粒種咖啡為異花授粉植物，相較自花授粉的小粒種咖啡，品種間遺傳距離相對(duì)較大，更易于構(gòu)建指紋圖譜。本研究利用5對(duì)SSR引物構(gòu)建了國(guó)內(nèi)25個(gè)主要中粒種咖啡品系的DNA指紋圖譜。5對(duì)SSR引物共擴(kuò)增出20條帶，條帶數(shù)量較少，便于品種鑒定比對(duì)、可操作性強(qiáng)，且所有擴(kuò)增條帶清晰、穩(wěn)定、可重復(fù)性好，對(duì)實(shí)際生產(chǎn)中優(yōu)良品種鑒定與推廣應(yīng)用具有實(shí)際生產(chǎn)意義。利用12對(duì)SSR引物可將59份小粒種種質(zhì)中的大部分區(qū)分開(kāi).但仍有相當(dāng)一部分未能區(qū)分，這可能與種質(zhì)間親緣關(guān)系過(guò)近，甚至種質(zhì)重復(fù)引進(jìn)、同種異名有關(guān)，如其中的CIFC7963（F6）、P1、P2、P3、P4、P5、PT、T5715、T8667同為Catimor系列品種，親緣關(guān)系十分接近，引種過(guò)程中也容易出現(xiàn)混淆。通過(guò)遺傳多樣性對(duì)現(xiàn)有小粒種咖啡種質(zhì)進(jìn)行親緣關(guān)系分析，進(jìn)而構(gòu)建核心種質(zhì)資源庫(kù)，在此基礎(chǔ)上進(jìn)行小粒種核心種質(zhì)指紋圖譜構(gòu)建更具可操作性，也更具實(shí)際應(yīng)用意義。

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