李青竹,張永春,鄭玉紅,楊柳燕,蔡友銘*
(1.上海市農(nóng)業(yè)科學(xué)院林木果樹研究所 上海市設(shè)施園藝技術(shù)重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室,上海 201106;2.江蘇省中國(guó)科學(xué)院植物研究所,江蘇 南京 210014)
石蒜屬(Lycorisspp.)是石蒜科(Amaryllidaceae)球根草本植物,富含多種石蒜屬植物特有的生物堿成分[1-3]。迄今為止,從石蒜屬植物中分離出超過(guò)500種結(jié)構(gòu)各異的生物堿類化合物,植物化學(xué)研究表明,該類化合物具有多種藥理學(xué)功能,藥用價(jià)值極高。其中,加蘭他敏和力可拉敏可用于治療阿爾茨海默癥,石蒜堿在抗菌、抗瘧疾、治療腫瘤、抗病毒和保護(hù)心血管等方面具有重要價(jià)值[4-7]。野生的石蒜資源是藥用生物堿最重要的來(lái)源,因此,對(duì)石蒜中加蘭他敏、力可拉敏和石蒜堿的含量進(jìn)行準(zhǔn)確定性和定量分析是育種和生物堿類物質(zhì)合成代謝研究的重要內(nèi)容之一。
目前高效液相色譜[8]、氣相色譜-質(zhì)譜聯(lián)用[9-10]和高效液相色譜-質(zhì)譜聯(lián)用[11-12]技術(shù)已被廣泛應(yīng)用于植物重要代謝產(chǎn)物含量、中藥藥用成分、化妝品活性成分和農(nóng)產(chǎn)品藥物殘留的分析中。上述分析方法也被用于石蒜生物堿類物質(zhì)的檢測(cè)分析,如高效液相色譜檢測(cè)(HPLC)法[13-15]。Quan等[15]通過(guò)對(duì)比樣品與已知的標(biāo)準(zhǔn)品在相同條件下的保留時(shí)間和峰面積,進(jìn)行了石蒜屬忽地笑中生物堿的定量研究,但植物樣本和試劑消耗極大,同時(shí),其僅采用HPLC方法根據(jù)物質(zhì)的保留時(shí)間進(jìn)行含量檢測(cè),無(wú)法對(duì)待測(cè)物質(zhì)進(jìn)行準(zhǔn)確定性,因此物質(zhì)定量結(jié)果不可靠,不能進(jìn)行結(jié)構(gòu)、定性和精確定量分析。Saliba等[16]采用HPLC-ESI-MS方法,對(duì)夏雪片蓮芽中的生物堿進(jìn)行定量分析,采用梯度洗脫,梯度洗脫前期和后期需很長(zhǎng)的分析時(shí)間,檢測(cè)程序時(shí)長(zhǎng)為36 min,加蘭他敏的洗脫時(shí)間為33 min,石蒜堿的洗脫時(shí)間為25.5 min,且在定性定量準(zhǔn)確性上仍有缺陷。上述兩種技術(shù)還存在提取時(shí)間長(zhǎng),操作繁瑣的問(wèn)題,為生物堿類物質(zhì)的快速定量分析帶來(lái)不便。
本研究基于UPLC-QTRAP-MS/MS這一準(zhǔn)確且應(yīng)用廣泛的定性定量方法[17-20],建立了快速同時(shí)測(cè)定石蒜屬中12個(gè)種加蘭他敏、力可拉敏和石蒜堿的分析方法,通過(guò)二級(jí)質(zhì)譜提供的母離子和子離子信息監(jiān)測(cè),能提高定性及定量分析的準(zhǔn)確性,將為研究石蒜屬植物中生物堿的積累規(guī)律和合成代謝調(diào)控提供快速、有效且準(zhǔn)確的分析方法。
超高效液相色譜儀Nexera UHPLC LC-30A(日本島津公司),配Waters ACQUITY UPLC BEH C18(150 mm×2.1 mm,1.7 μm)液相色譜柱;Qtrap 5500質(zhì)譜檢測(cè)系統(tǒng)(美國(guó)AB Sciex公司),配有電噴霧(ESI)離子源和Analyst 1.6.2工作站; SB-5200DT超聲波清洗機(jī)(寧波新芝生物科技股份有限公司,超聲功率200 W,40 kHz) ; BS210S型電子分析天平(萬(wàn)分之一,北京賽多利斯天平有限公司);標(biāo)準(zhǔn)品溴氫加蘭他敏購(gòu)于梯希愛(上海)化成工業(yè)發(fā)展有限公司,純度>98%,力可拉敏和石蒜堿標(biāo)準(zhǔn)品均購(gòu)自上海安譜實(shí)驗(yàn)科技股份有限公司,純度>98%,實(shí)驗(yàn)用水為Millipore純水器制備的超純水,乙醇、甲醇和乙腈為色譜純(德國(guó)默克公司),其余試劑均為分析純。
1.2.1標(biāo)準(zhǔn)溶液的制備稱取適量加蘭他敏、力可拉敏、石蒜堿標(biāo)準(zhǔn)品各0.010 g,分別用甲醇溶解并定容至100 mL,得到上述3種物質(zhì)的標(biāo)準(zhǔn)儲(chǔ)備液(質(zhì)量濃度均為100 mg/L)。
標(biāo)準(zhǔn)中間液:分別準(zhǔn)確移取1 mL上述標(biāo)準(zhǔn)儲(chǔ)備液置于100 mL容量瓶中,用甲醇定容配成1.0 mg/L的混合標(biāo)準(zhǔn)中間液;標(biāo)準(zhǔn)工作液:根據(jù)需要移取適量混合標(biāo)準(zhǔn)中間液,分別用甲醇稀釋成質(zhì)量濃度為0.5、1、5、10、100、500 μg/L的標(biāo)準(zhǔn)工作溶液。
1.2.2材料與樣品制備方法供試石蒜屬植物材料由江蘇省中國(guó)科學(xué)院植物研究所(南京中山植物園)提供,在上海市農(nóng)業(yè)科學(xué)院種質(zhì)資源圃保存種植,由南京林業(yè)大學(xué)王良桂教授指導(dǎo)采集,并由江蘇省中國(guó)科學(xué)院植物研究所鄭玉紅鑒定,憑證標(biāo)本編號(hào)如下:長(zhǎng)筒石蒜(Lycorislongituba,0653969)、香石蒜(Lycorisincarnata,0653959)、換錦花(Lycorissprengeri,0653967)、石蒜(Lycorisradiata,0653965)、忽地笑(Lycorisaurea,0653958)、紅藍(lán)石蒜(Lycorishaywardii,0653964)、矮小石蒜(Lycorisradiatavar.pumila,0653966)、中國(guó)石蒜(Lycorischinensis,0653960)、稻草石蒜(Lycorisstraminea,0646254)、鹿蔥(Lycorissquamigera,0653962)、陜西石蒜(Lycorisshaanxiensis,726057)和乳白石蒜(Lycorisalbiflora,0653963),憑證標(biāo)本存于江蘇省中國(guó)科學(xué)院植物研究所標(biāo)本館。以鱗莖為待測(cè)樣品,取0.2 g鮮樣冷凍干燥后,研磨成粉,取石蒜鱗莖干樣0.02 g,置于EP管中加入2 mL 70%乙醇,超聲提取30 min,12 000 r/min離心10 min,取上清液,濾渣加入2 mL 70%乙醇再次超聲提取30 min,渦旋1 min,12 000 r/min 離心10 min,取上清液,合并兩次上清液,氮吹濃縮至近干,以1 mL 0.1%甲酸水溶液-乙腈(體積比95∶5)溶解,稀釋1 000倍至0.5~500 μg/L,過(guò)0.22 μm濾膜。
1.2.3含量計(jì)算將待測(cè)樣品的質(zhì)譜峰面積數(shù)據(jù)代入所得到的線性方程中,獲得待測(cè)樣品溶液中目標(biāo)分析物的質(zhì)量濃度C(μg/L),再根據(jù)復(fù)溶的溶劑體積V(mL),稀釋倍數(shù)D,以及樣品質(zhì)量M(干重,單位為g),計(jì)算樣品中目標(biāo)分析物的含量m(單位為ng/g干重),含量計(jì)算公式為:m=(C×V×D)/M。
1.3.1色譜條件液相色譜柱:Waters ACQUITY UPLC BEH C18(150 mm×2.1 mm,1.7 μm);柱溫:50 ℃;進(jìn)樣量:5 μL;流速為0.2 mL/min;流動(dòng)相:A為0.1%甲酸-水溶液,B為乙腈;梯度洗脫條件:0~3.5 min,95%A;3.5~4.5 min,95%~40%A;4.5~6 min,95%A。
1.3.2質(zhì)譜條件離子源:電噴霧離子源(ESI);掃描及采集方式:正離子掃描下以多反應(yīng)監(jiān)測(cè)(MRM)模式進(jìn)行分析;離子源噴霧電壓4 500 V;霧化氣Gas1:55;輔助氣Gas2:55;氣簾氣30。
考察了乙腈-水、甲醇-水、乙腈-0.1%甲酸水溶液、甲醇-0.1%甲酸水溶液等不同流動(dòng)相的洗脫效果,發(fā)現(xiàn)乙腈作為流動(dòng)相時(shí)粘度小、傳質(zhì)快、柱壓低且目標(biāo)物質(zhì)的保留時(shí)間更短,在乙腈中加入一定比例的甲酸可提高檢測(cè)的靈敏度、減少色譜峰拖尾,改善分析物的峰形,經(jīng)優(yōu)化選擇乙腈-0.1%甲酸水溶液作為流動(dòng)相。
色譜分離樣品有梯度和等度洗脫2種方式,梯度洗脫適用于多種復(fù)雜成分的物質(zhì)分離,本研究同時(shí)檢測(cè)3種生物堿類物質(zhì),等度洗脫無(wú)法實(shí)現(xiàn)物質(zhì)之間的有效分離,因此選擇梯度洗脫。在優(yōu)化的色譜條件下,加蘭他敏的保留時(shí)間為2.86 min,力可拉敏的保留時(shí)間為2.31 min,石蒜堿的保留時(shí)間為1.95 min。
在質(zhì)譜條件的優(yōu)化中,根據(jù)加蘭他敏、力可拉敏和石蒜堿的結(jié)構(gòu)并結(jié)合前人研究結(jié)果[16],發(fā)現(xiàn)三者在正離子模式下具有較高的響應(yīng)和靈敏度及較清晰的質(zhì)譜圖,因此質(zhì)譜的離子化模式選擇正離子模式。3種物質(zhì)的提取離子色譜圖及MS/MS質(zhì)譜圖見圖1,質(zhì)譜參數(shù)見表1。
表1 優(yōu)化的質(zhì)譜條件參數(shù)Table 1 Optimized MS/MS parameters for the determination of Gal,Lycm and Lyc
對(duì)提取溶劑(50%、70%、90%乙醇),超聲波提取時(shí)間(15、30 min)和二次提取方法進(jìn)行考察(表2),結(jié)果表明,采用70%乙醇作為溶劑,超聲波輔助提取2次,每次提取30 min具有較高的提取效率。
圖1 樣品的總離子流圖(A)及加蘭他敏(B)、力可拉敏(C)與石蒜堿(D)的MS/MS質(zhì)譜圖Fig.1 TIC chromatogram of the extract from sample(A),and MS/MS spectrum of galanthamine(B),lycoramine(C)and lycorine(D)
SolventExtractiontime/minGalcontent/(μg·g-1DW)Lycmcontent/(μg·g-1DW)Lyccontent/(μg·g-1DW)50%Ethanol15390 1384 83932 350%Ethanol30417 2410 94164 570%Ethanol15436 5428 34302 170%Ethanol30464 9466 24515 690%Ethanol15413 4397 54200 690%Ethanol30436 3434 44389 7
DW:dry weight(干重)
2.3.1線性關(guān)系與檢出限按“1.2”方法進(jìn)行標(biāo)準(zhǔn)溶液配制,在優(yōu)化實(shí)驗(yàn)條件下采用本方法進(jìn)行測(cè)定,以峰面積(Y)對(duì)相應(yīng)標(biāo)準(zhǔn)溶液濃度(X,μg/L)繪制標(biāo)準(zhǔn)曲線,得到線性方程、相關(guān)系數(shù)以及線性范圍。以信噪比(S/N)為3確定儀器的檢出限(IDL),以EPA定義的方法確定方法的檢出限(MDL),結(jié)果列于表3。結(jié)果表明,3種生物堿在0.5~500 μg/L質(zhì)量濃度范圍內(nèi)線性良好(r2>0.999),以儀器在信噪比為3時(shí)能檢測(cè)到的最低濃度計(jì)算得IDL為0.1 μg/L。根據(jù)美國(guó)EPA對(duì)MDL認(rèn)定方法,利用本文的分析步驟,對(duì)加標(biāo)樣品進(jìn)行 8次平行測(cè)定(加標(biāo)濃度為預(yù)估檢出限的1~5倍),結(jié)果經(jīng) Grubbs檢驗(yàn)可以用于檢出限的計(jì)算,根據(jù)8個(gè)平行測(cè)定的標(biāo)準(zhǔn)偏差S和t分布值,利用公式MDL=t(8-1,0.99)×S確定該法測(cè)定Gal、Lycm、Lyc的MDL分別為0.34、0.25、0.25 μg/L。
表3 3種生物堿的線性回歸方程及檢出限Table 3 Linear regression equation,MDL and IDL of three types of alkaloids
2.3.2精密度、重復(fù)性及穩(wěn)定性取同一Gal、Lycm和Lyc標(biāo)準(zhǔn)品溶液,重復(fù)進(jìn)樣5次,計(jì)算Gal、Lycm和Lyc峰面積的相對(duì)標(biāo)準(zhǔn)偏差(RSD)分別為0.5%、0.79%、0.4%,說(shuō)明儀器精密度較好。取同一樣品,按照“1.2”方法制備供試品溶液,進(jìn)樣重復(fù)測(cè)定 5次,計(jì)算Gal、Lycm和Lyc含量的RSD分別為2.0%、3.4%、3.6%,說(shuō)明方法重復(fù)性較好。取同一樣品溶液,分別在 0、3、6、9、24 h 進(jìn)樣5次,測(cè)得Gal、Lycm和Lyc含量的RSD分別為3.4%、3.5%、3.0%,說(shuō)明供試品溶液在24 h內(nèi)穩(wěn)定性較好。
2.3.3加標(biāo)回收率實(shí)驗(yàn)取已知含量的0.10 g干重樣品,精密稱定5份,加入一定量的標(biāo)準(zhǔn)品溶液,使供試品溶液中Gal、Lycm和Lyc的質(zhì)量濃度分別為25.00、10.00、40.00 mg/L,按“1.2”方法制備供試品溶液并進(jìn)行測(cè)定,3種生物堿的平均回收率為97.2%~98.6%,RSD為0.8%~4.3%,表明該方法具有較好的準(zhǔn)確度,可以用于樣品中3種生物堿的分析(見表4)。
表4 供試品溶液中3種生物堿的加標(biāo)回收率與相對(duì)標(biāo)準(zhǔn)偏差(n=5)Table 4 Spiked recoveries and RSDs of three types of alkaloids in test solutions(n=5)
采用優(yōu)化的方法及條件,測(cè)定石蒜屬12個(gè)種3種生物堿的含量 (以干重計(jì)),結(jié)果顯示,加蘭他敏的含量在石蒜屬不同種間差異可達(dá) 20倍,含量范圍為21.98~496.77 μg/g DW(表5)。加蘭他敏含量以長(zhǎng)筒石蒜、忽地笑和中國(guó)石蒜較高,而紅藍(lán)石蒜、鹿蔥和矮小石蒜含量很低;石蒜堿含量以長(zhǎng)筒石蒜、香石蒜和陜西石蒜較高,在鱗莖中的含量最高約為0.45%,除乳白石蒜較低外,種間差別約達(dá)45倍;力可拉敏含量以長(zhǎng)筒石蒜、換錦花、紅藍(lán)石蒜較高,在鱗莖中的含量最高約為0.046%,除忽地笑、乳白石蒜和鹿蔥中極低外,種間差別約為38倍。
表5 石蒜屬3種生物堿的含量(n=5)Table 5 Three types of alkaloids contents in Lycoris spp.(n=5)
本文建立了液相色譜-串聯(lián)二級(jí)質(zhì)譜檢測(cè)石蒜中3種生物堿的新方法,與傳統(tǒng)方法相比,本方法的樣品前處理具有操作簡(jiǎn)單、有機(jī)溶劑消耗少、分析快速、分離效果好等特點(diǎn)。與已有文獻(xiàn)相比,如Saliba等[16]的方法主要提取步驟為:甲醇提取24 h、濃縮、硫酸酸化、氯仿抽提、蒸發(fā)、復(fù)溶、過(guò)濾,而本方法采取快速簡(jiǎn)化的提取步驟,經(jīng)過(guò)2次超聲波輔助提取、離心、蒸發(fā)、復(fù)溶、過(guò)濾,提取過(guò)程快速簡(jiǎn)單。Quan等[15]建立的HPLC方法中單次提取石蒜鱗莖材料需鮮樣20 g,甲醇110 mL,鹽酸10 mL,氯仿15 mL,對(duì)植物樣本和試劑消耗極大,本方法待測(cè)樣品鮮重可低至0.2 g,提取劑體積為2~5 mL。在保證提取效果的前提下,極大節(jié)約了植物材料和提取試劑。李明凱等[14]和Saliba等[16]的方法檢測(cè)程序長(zhǎng)達(dá)30~50 min,而本方法的檢測(cè)程序時(shí)間≤6 min,3種物質(zhì)的洗脫時(shí)間<3 min,并且串聯(lián)了二級(jí)質(zhì)譜,分析了加蘭他敏、力可拉敏和石蒜堿子離子的信息,經(jīng)方法學(xué)確認(rèn),取得了很好的提取和分析效果,大大提高了分析速度和準(zhǔn)確性。通過(guò)進(jìn)一步的拓展研究,本方法可用于3種生物堿類物質(zhì)的提取和檢測(cè),是一種簡(jiǎn)捷、高效和準(zhǔn)確的檢測(cè)方法。
本研究利用超聲波輔助進(jìn)行二次提取,并以液相色譜-質(zhì)譜聯(lián)用技術(shù)為基礎(chǔ),對(duì)石蒜屬植物中3種生物堿進(jìn)行檢測(cè),分析時(shí)間在6 min內(nèi)。通過(guò)對(duì)3種生物堿的保留時(shí)間、母離子、子離子的三級(jí)信息整合,特別是二級(jí)質(zhì)譜中多組母離子/子離子對(duì)的信息監(jiān)測(cè),能確保定性和定量的準(zhǔn)確性。此方法能快速提取并準(zhǔn)確定性定量分析石蒜植物中的加蘭他敏、力可拉敏和石蒜堿,大幅縮短分析時(shí)間,提高分析準(zhǔn)確度,為研究石蒜植物中上述生物堿類物質(zhì)的積累規(guī)律和合成代謝調(diào)控提供了有效且準(zhǔn)確的分析方法。
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