張現(xiàn)峰，蘆靜波，王學(xué)梅

(1.蚌埠學(xué)院 材料與化學(xué)工程學(xué)院，安徽 蚌埠 233030；2.安徽省多糖藥物工程技術(shù)研究中心，皖南醫(yī)學(xué)院 藥學(xué)院， 安徽 蕪湖 241000)

精確測(cè)量溫度變化對(duì)深刻理解納米體系的反應(yīng)機(jī)理與細(xì)胞中的生化及生理行為均有重要意義[1-2]。目前，納米/微米空間的溫度測(cè)量方法主要有熱電偶、熱阻抗和紅外線等[3-5]，原位和非接觸溫度測(cè)量仍是難題。熒光碳量子點(diǎn)(CQDs)是一類近似球形，尺寸小于10 nm的納米粒子，由少量分子或原子組成[6-7]。自被發(fā)現(xiàn)以來(lái)，碳量子點(diǎn)在分析檢測(cè)、生物傳感、光催化以及光電子器件等領(lǐng)域引起了廣泛關(guān)注[8-10]。與傳統(tǒng)的半導(dǎo)體量子點(diǎn)和有機(jī)染料相比，碳量子點(diǎn)具有毒性低、生物相容性良好、光學(xué)性質(zhì)穩(wěn)定、化學(xué)性質(zhì)穩(wěn)定，以及表面易功能化等優(yōu)點(diǎn)[11-12]。有文獻(xiàn)報(bào)道碳量子點(diǎn)的熒光強(qiáng)度隨著溫度的增加而減小[13]。然而，由于這些碳量子點(diǎn)的熒光強(qiáng)度與溫度弱的線性關(guān)系，限制了其在原位溫度傳感器方面的應(yīng)用。最近，Guo課題組[14]通過(guò)煅燒山竹果肉制備了熒光碳量子點(diǎn)，隨著該碳量子點(diǎn)溫度從10 ℃增加到90 ℃，其熒光強(qiáng)度減小約50%，熒光強(qiáng)度與溫度線性關(guān)系良好(r2=0.984 2)，可以作為熒光溫度探針。

另外，熒光量子產(chǎn)率(QY)是評(píng)判熒光材料的重要性質(zhì)，量子產(chǎn)率的高低直接影響材料的實(shí)際應(yīng)用。然而，目前很多方法制備的碳量子點(diǎn)熒光量子產(chǎn)率偏低，大大限制了其作為熒光納米探針在細(xì)胞成像等方面的應(yīng)用。為了增強(qiáng)碳量子點(diǎn)的性能和開(kāi)發(fā)其它潛在應(yīng)用，很多學(xué)者期望采用簡(jiǎn)便、有效的方法合成高熒光量子產(chǎn)率的碳量子點(diǎn)[15-16]。目前，提高碳量子點(diǎn)的熒光量子產(chǎn)率，主要通過(guò)化學(xué)還原、表面鈍化和修飾等方法[17-19]。然而，這些方法需較長(zhǎng)的反應(yīng)時(shí)間，或需要有毒試劑，且需要復(fù)雜的后處理過(guò)程。因此，尋找通用、簡(jiǎn)便的方法合成高熒光量子產(chǎn)率的碳量子點(diǎn)越來(lái)越受到人們的重視。相比而言，通過(guò)氮摻雜方法合成碳量子點(diǎn)是提高碳量子點(diǎn)熒光量子產(chǎn)率的一種有效而簡(jiǎn)便的方法[20-21]，但目前文獻(xiàn)報(bào)道并不多。

目前以草酸和尿素為混合碳源，超純水為溶劑，通過(guò)微波加熱一步合成氮摻雜的碳量子點(diǎn)尚未見(jiàn)報(bào)道。本研究發(fā)現(xiàn)，相比于單獨(dú)使用草酸為碳源，利用尿素進(jìn)行氮摻雜可以得到較高熒光量子產(chǎn)率的碳量子點(diǎn)。另外，隨著溫度的增加，碳量子點(diǎn)的熒光強(qiáng)度減小，當(dāng)溫度反向降低時(shí)，其熒光強(qiáng)度能夠恢復(fù)到原始值。在10～80 ℃溫度范圍內(nèi)，相對(duì)熒光強(qiáng)度與溫度之間存在良好的線性關(guān)系。本文通過(guò)對(duì)所合成的碳量子點(diǎn)的表征、細(xì)胞毒性以及細(xì)胞成像實(shí)驗(yàn)，證明合成的碳量子點(diǎn)水溶性好、抗鹽性能優(yōu)異、穩(wěn)定性強(qiáng)、細(xì)胞毒性小，有望作為溫敏性的光學(xué)納米探針在細(xì)胞研究方面得到應(yīng)用。

1 實(shí)驗(yàn)部分

1.1 試劑與儀器

小鼠結(jié)腸癌細(xì)胞(CT26.WT)購(gòu)于上海生化與細(xì)胞研究所，草酸購(gòu)于天津市潤(rùn)金特化學(xué)品有限公司，尿素和DMSO購(gòu)于上海阿拉丁化學(xué)試劑有限公司，RPMI-1640培養(yǎng)基和FBS購(gòu)于上海Gibco生命技術(shù)公司，雙抗(青霉素/鏈霉素，濃度104U/mL)購(gòu)于碧云天生物試劑有限公司。實(shí)驗(yàn)用水為超純水，所用試劑均為分析純。

家用格蘭仕微波爐(廣東格蘭仕微波爐電器公司，G70F20CN3L-C2)，F(xiàn)97PR0熒光分光光度計(jì)(上海棱光技術(shù)有限公司)，TU-1901型紫外-可見(jiàn)光譜儀(北京普析通用儀器有限責(zé)任公司)，F(xiàn)TIR-850型傅立葉變換紅外光譜儀(天津港東科技發(fā)展股份有限公司)，JEM-2100型透射電子顯微鏡(日本電子株式會(huì)社)，PHS-3C型pH計(jì)(上海雷磁儀器儀表有限公司)，Labconco冷凍干燥系統(tǒng)(美國(guó)Labconco公司)，Bio Rad 550型酶標(biāo)儀(美國(guó)伯樂(lè)公司)，Leica SP8激光掃描共聚焦顯微鏡(德國(guó)徠卡微系統(tǒng)股份公司)。

1.2 熒光碳量子點(diǎn)的制備

用電子天平準(zhǔn)確稱取1.8 g草酸和0.6 g尿素置于潔凈的100 mL錐形瓶中，加入25 mL超純水，磁力攪拌15 min至草酸與尿素完全溶解，然后放入微波爐(560 W)中加熱10 min。取出錐形瓶，冷卻，加入20 mL超純水，超聲5 min，再用濾膜(0.22 μm)過(guò)濾，除去濾渣，所得濾液即為碳量子點(diǎn)的水溶液。經(jīng)過(guò)冷凍干燥后，稱重，溶于超純水中用于細(xì)胞毒性和細(xì)胞成像測(cè)試。

1.3 熒光碳量子點(diǎn)的性能與結(jié)構(gòu)表征

在5 mL離心管中，加入150 μL碳量子點(diǎn)儲(chǔ)備液(10 mg/mL)，加水稀釋至3 mL，混合均勻，340 nm激發(fā)光下測(cè)試碳量子點(diǎn)的熒光光譜(波長(zhǎng)范圍360～600 nm)。取20 μL碳量子點(diǎn)水溶液滴在銅網(wǎng)上，靜置空氣中干燥，用透射電子顯微鏡(TEM)在200 kV加速電壓下測(cè)試碳量子點(diǎn)的形貌和粒徑。碳量子點(diǎn)的紅外光譜(FTIR)表征采用KBr壓片法(掃描范圍4 000～400 cm-1，分辨率4 cm-1，掃描次數(shù)32次)。

1.4 熒光量子產(chǎn)率測(cè)定

首先將硫酸奎寧溶于0.1 mol/L硫酸溶液中(量子產(chǎn)率為54%)，分別測(cè)量碳量子點(diǎn)和硫酸奎寧的積分熒光強(qiáng)度(360 nm激發(fā))和吸光度(360 nm處)，然后按照下式計(jì)算碳量子點(diǎn)的熒光量子產(chǎn)率：

式中，st 和x分別代表硫酸奎寧標(biāo)準(zhǔn)溶液和碳量子點(diǎn)溶液，φ和I分別為熒光量子產(chǎn)率和積分熒光強(qiáng)度，A和η分別為吸光度和折光率(均為1.33)，為了減小再吸收效應(yīng)，保持測(cè)試溶液360 nm處的吸光度小于0.05。

1.5 細(xì)胞毒性測(cè)試

收集CT26.WT細(xì)胞，調(diào)整細(xì)胞濃度，接種于96孔板中，置于CO2培養(yǎng)箱中培養(yǎng)12 h，分別加入不同濃度的碳量子點(diǎn)溶液(0～1 000 μg/mL)培養(yǎng)24 h。實(shí)驗(yàn)設(shè)置空白對(duì)照組，每組設(shè)6個(gè)平行復(fù)孔，待培養(yǎng)結(jié)束前4 h，加入10 μL的MTT溶液終止培養(yǎng)，CO2培養(yǎng)箱內(nèi)繼續(xù)孵育4 h，加入DMSO溶解藍(lán)紫色結(jié)晶。測(cè)定各孔在490 nm處的光密度(OD)值。實(shí)驗(yàn)至少重復(fù)3次。不同濃度碳量子點(diǎn)存在下的細(xì)胞存活率根據(jù)以下公式計(jì)算：細(xì)胞存活率(%)=OD實(shí)驗(yàn)組/OD對(duì)照組×100%。

1.6 細(xì)胞成像實(shí)驗(yàn)

培養(yǎng)皿中培養(yǎng)CT26.WT細(xì)胞，調(diào)整細(xì)胞濃度，置于1 mL的碳量子點(diǎn)溶液(1 mg/mL)中處理細(xì)胞24 h，結(jié)束后去培養(yǎng)基，PBS洗滌細(xì)胞3次，激光掃描共聚焦顯微鏡下觀察并拍照。

2 結(jié)果與討論

2.1 草酸及尿素質(zhì)量比對(duì)碳量子點(diǎn)熒光量子產(chǎn)率的影響

表1 不同質(zhì)量比的草酸和尿素制備的碳量子點(diǎn)的熒光量子產(chǎn)率Table 1 Quantum yields(QYs) of CQDs synthesized by different mass ratios of oxalic acid and urea

為了合成量子產(chǎn)率較高的碳量子點(diǎn)，首先研究了不同質(zhì)量比的草酸和尿素對(duì)合成的碳量子點(diǎn)熒光量子產(chǎn)率的影響。從表1可以看出，尿素可以有效提高碳量子點(diǎn)的熒光量子產(chǎn)率。隨著尿素比例的增加，氮含量增加，碳量子點(diǎn)的量子產(chǎn)率逐漸提高，這是由于得到的碳量子點(diǎn)中摻雜的氮主要是石墨型氮，有利于熒光量子產(chǎn)率[21-23]提高。當(dāng)草酸和尿素質(zhì)量比為3∶1時(shí)，得到的碳量子點(diǎn)熒光量子產(chǎn)率最高，為9.5%。繼續(xù)增加尿素比例，熒光量子產(chǎn)率反而下降，這可能是因?yàn)榈康脑黾樱淖兞颂剂孔狱c(diǎn)的結(jié)構(gòu)，進(jìn)而改變了其光學(xué)性質(zhì)[20]。

2.2 碳量子點(diǎn)的表征

圖1 碳量子點(diǎn)的紫外-可見(jiàn)吸收光譜(A)及激發(fā)和發(fā)射光譜(B)Fig.1 UV-Vis absorption spectrum(A) and excitation and emission spectra(B)of the synthesized CQDs inset:photographs of CQDs solution taken under visible light and 365 nm UV light

圖2 碳量子點(diǎn)在不同激發(fā)波長(zhǎng)(310～390 nm)下的熒光發(fā)射光譜Fig.2 Fluorescence spectra of the synthesized CQDs at different excitation wavelengths from 310 nm to 390 nm

圖3A為合成碳量子點(diǎn)的透射電鏡圖片，由圖中可以看出，該方法合成的碳量子點(diǎn)近似球形，單分散性良好，無(wú)團(tuán)聚現(xiàn)象，高斯擬合曲線顯示碳量子點(diǎn)的平均粒徑約3.8 nm(圖3B)。

圖3 合成碳量子點(diǎn)的TEM圖片(A)和粒徑分布(B)

圖4 碳量子點(diǎn)的紅外光譜圖Fig.4 FTIR spectrum of CQDs

2.3 碳量子點(diǎn)的熒光性質(zhì)

制備的碳量子點(diǎn)在10～80 ℃的溫度范圍內(nèi)，具有良好的溫度敏感的熒光性質(zhì)(圖5A)。隨著溫度從10 ℃增加到80 ℃，碳量子點(diǎn)在410 nm處的熒光強(qiáng)度約減小25%，當(dāng)溫度降低時(shí)，其熒光強(qiáng)度又恢復(fù)到原始值(圖5B)。以10 ℃時(shí)的熒光強(qiáng)度為參比，相對(duì)熒光強(qiáng)度與溫度之間存在良好的線性關(guān)系，加熱和冷卻過(guò)程中，線性擬合的相關(guān)系數(shù)(r2)分別為0.980和0.990。碳量子點(diǎn)的熒光強(qiáng)度對(duì)溫度的線性響應(yīng)，可能是碳量子點(diǎn)表面大量的含氧基團(tuán)和氫鍵的協(xié)同作用所引起[27]，這說(shuō)明此量子點(diǎn)在溫度相關(guān)的熒光傳感領(lǐng)域有潛在的應(yīng)用價(jià)值。

圖5 碳量子點(diǎn)在不同溫度下的熒光光譜(A)和碳量子點(diǎn)的相對(duì)熒光強(qiáng)度(以10 ℃時(shí)的熒光強(qiáng)度為參比)與溫度之間的關(guān)系(B)Fig.5 Fluorescence spectra of the as-prepared CQDs at various temperatures(A) and the relative fluorescence intensity(I/I0) of CQDs as a function of temperature during heating and cooling processes(the fluorescence intensity at 10 ℃ as the reference)(B)

研究了不同離子強(qiáng)度(通過(guò)不同NaCl濃度調(diào)控)對(duì)熒光碳量子點(diǎn)的影響。碳量子點(diǎn)溶液中含有不同濃度NaCl(0～1.0 mol/L)時(shí)，碳量子點(diǎn)的熒光強(qiáng)度和峰特征無(wú)明顯的變化，說(shuō)明合成的碳量子點(diǎn)具有良好的抗鹽能力。

2.4 碳量子點(diǎn)的細(xì)胞成像分析

用MTT實(shí)驗(yàn)研究了碳量子點(diǎn)的細(xì)胞毒性。實(shí)驗(yàn)結(jié)果顯示，當(dāng)碳量子點(diǎn)質(zhì)量濃度小于600 μg/mL 時(shí)，CT26.WT細(xì)胞存活率大于92%，碳量子點(diǎn)質(zhì)量濃度為1 000 μg/mL 時(shí)，CT26.WT細(xì)胞存活率為85%。由于獨(dú)特的熒光性質(zhì)、良好的水溶性以及低毒性，制備的碳量子點(diǎn)可以用于細(xì)胞標(biāo)記和成像。圖6為碳量子點(diǎn)標(biāo)記的CT26.WT細(xì)胞在405 nm激發(fā)光下的激光共聚焦成像圖。從圖6可以看出，細(xì)胞在激發(fā)光下發(fā)出明亮的藍(lán)光，說(shuō)明碳量子點(diǎn)已成功標(biāo)記了CT26.WT細(xì)胞，其主要通過(guò)細(xì)胞內(nèi)吞作用分布在細(xì)胞膜和細(xì)胞質(zhì)中。同時(shí)，未觀察到任何細(xì)胞損傷，說(shuō)明細(xì)胞毒性較小。以上結(jié)果顯示制備的碳量子點(diǎn)有望作為光學(xué)探針在細(xì)胞成像方面得到應(yīng)用。

3 結(jié) 論

以草酸和尿素為混合碳源，采用微波法一步快速合成了具有藍(lán)色熒光的氮摻雜的碳量子點(diǎn)，所需原料簡(jiǎn)單易得，實(shí)驗(yàn)操作簡(jiǎn)便。對(duì)碳量子點(diǎn)進(jìn)行氮摻雜能有效提高其熒光量子產(chǎn)率，當(dāng)草酸和尿素質(zhì)量比為3∶1時(shí)，熒光量子產(chǎn)率最高，為9.5%，遠(yuǎn)高于不摻氮的碳量子點(diǎn)。制備的氮摻雜的碳量子點(diǎn)近似球形，具有良好的水溶性、抗鹽性能和穩(wěn)定性。同時(shí)，碳量子點(diǎn)的相對(duì)熒光強(qiáng)度和溫度之間存在良好的線性響應(yīng)關(guān)系，說(shuō)明此量子點(diǎn)在溫度相關(guān)的熒光傳感領(lǐng)域有潛在的應(yīng)用價(jià)值。MTT細(xì)胞存活率實(shí)驗(yàn)和共聚焦熒光成像測(cè)試表明制備的碳量子點(diǎn)細(xì)胞毒性小，生物相容性好，有望作為熒光納米探針應(yīng)用于細(xì)胞成像等領(lǐng)域。

圖6 CT26.WT細(xì)胞和碳量子點(diǎn)(1 mg/mL)培育24 h后的共聚焦熒光圖像Fig.6 Confocal fluorescence images of CT26.WT cells incubated with CQDs(1 mg/mL) for 24 h A.bright field ,B.excitation wavelength of 405 nm,C.merged images of the A and B images

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