孫昊巖，蔣立文，李珊珊，孫孟新，褚秀玲，蘇建青

（聊城大學(xué)農(nóng)學(xué)院，山東 聊城 252000）

隨著食品安全監(jiān)管的加強和抗生素飼料添加劑的禁用。肉雞消化道保健的抗生素替代品成為集約化養(yǎng)禽業(yè)的研究熱點，中藥草、益生菌和生物制劑都具有廣闊的應(yīng)用前景。微生態(tài)制劑作為一種自然、環(huán)保的生物制劑，具有較高的開發(fā)和應(yīng)用價值[1]。其中芽孢桿菌因為對酸、高溫、膽鹽和抗菌素等具有很強的抵抗力，是理想的微生態(tài)制劑研發(fā)菌，在1996年就被寫入飼料添加劑目錄。試驗研究和臨床應(yīng)用顯示芽孢桿菌進入家禽消化道以后，能很快開始繁殖，消耗消化道內(nèi)的氧氣，產(chǎn)生消化酶、抗菌肽和維生素等有益物質(zhì)，提高消化道的免疫力。芽孢桿菌可以產(chǎn)生多種有益消化的酶如淀粉酶、甘露聚糖酶、纖維素酶等，促進飼料的消化和降解，提高飼料生物利用率。芽孢桿菌可以通過非核糖體肽途徑合成脂肽化合物和聚酮化合物，抑制細菌、病毒和真菌的繁殖，拮抗病原菌的生長，有效預(yù)防消化道疾病[2]。菌種的安全性和益生特性是關(guān)系到芽孢桿菌保健功能的重要基礎(chǔ)。來自于本體動物的菌種具有更高的安全性，為了分離到雞源芽孢桿菌作為益生菌，試驗從肉雞消化道中分出芽孢桿菌，并對其理化特征和益生性進行研究，為臨床篩選高效、安全和綠色的微生態(tài)菌種奠定基礎(chǔ)。

1 材料和方法

1.1 試劑和設(shè)備 營養(yǎng)瓊脂、酵母粉、蛋白胨購自安徽博美；細菌微量生化鑒定管和藥敏紙片購自杭州濱河微生物研究所；革蘭氏碘染液、淀粉、氯化鈉、可溶性淀粉、豬膽鹽等購自阿拉丁。設(shè)備包括高壓蒸汽滅菌鍋、雷氏pH計、蘇州超凈工作臺、恒溫水浴鍋、臺式高速離心機、奧林巴斯光學(xué)顯微鏡，恒溫水浴搖床等。

1.2 方法

1.2.1 芽孢桿菌的分離 采用稀釋涂布平板法分離[3]，取健康肉雞盲腸糞便5g，置入100ml的離心管中，加生理鹽水30ml，震蕩混勻，紗布過濾。將濾液放入50ml的玻璃離心管中，在80℃水浴中加熱10min，取出后在室溫靜置10min，等溫度下降后，用一次性無菌吸管取適量液體，加到營養(yǎng)瓊脂平板上，用涂布器涂勻，靜置30min后，倒置放入37℃培養(yǎng)箱中培養(yǎng)。24h后觀察有無菌落出現(xiàn)。

1.2.2 芽孢桿菌的純化 挑取平板上形態(tài)較好的單個克隆菌落在LB營養(yǎng)瓊脂上進行劃線培養(yǎng)，重復(fù)劃接種培養(yǎng)3次，最后，得到純的菌株。將純化的單一菌株進行擴增培養(yǎng)，選取菌落形態(tài)典型的單個菌落加入5ml的LB培養(yǎng)基中，37℃，150r/min恒溫水浴搖床培養(yǎng)16h，并在培養(yǎng)后加入甘油-80℃凍存，用于下面的鑒定和性能研究。

1.2.3 芽孢桿菌的形態(tài)鑒定 取一滴純培養(yǎng)的菌液，用適量的甘油鹽水稀釋后涂片，革蘭氏染色，通過光學(xué)顯微鏡觀察細菌形態(tài)和大小。染色方法見說明書。

1.2.4 芽孢桿菌的生化鑒定 生化試驗按照試劑盒說明操作，對分離到的細菌進行VP、甲基紅（MR）、葡萄糖、麥芽糖、乳糖、硝酸鹽還原試驗、產(chǎn)H2S試驗、吲哚試驗、明膠液化試驗和糖酵解等試驗。參照伯杰細菌鑒定手冊[4]及常見細菌系統(tǒng)鑒定手冊[5]鑒別。

1.2.5 芽孢桿菌益生性研究

1.2.5.1 細菌計數(shù)試驗 將LB培養(yǎng)出來的細菌采用有限稀釋法進行計數(shù)。既吸取100μl菌液，加入900μl的LB培養(yǎng)基中，混勻，然后再吸取稀釋后的 100μl菌液，加入 900μl的 LB培養(yǎng)基中，混勻，以此類推。每個稀釋度吸取100μl菌液涂板計數(shù)，重復(fù)三次。計數(shù)細菌的含量。

1.2.5.2 耐高溫試驗 取5ml菌液，分別加入15個20ml的離心管中，每3個離心管一組，分別放到 60、70、80、90℃和 100℃的水浴中 10min， 然后取出來冷卻到室溫，采用平板稀釋法計數(shù)，以原菌液作為對照，觀察溫度對芽孢桿菌存活率的影響。菌種存活率 (%)=［1－(對照組含菌量－不同條件處理后含菌量)/對照組含菌量］×100%。

1.2.5.3 耐酸試驗 取20ml菌液，分別加入4個50ml的小燒杯中，用0.1mol/L HCl分別將pH值調(diào)成 2.0、3.0、4.0、5.0，每個 pH 值的菌液取 5ml分裝到10ml的離心管中，每個pH值3個。放到37℃的搖床中培養(yǎng)2h，然后取出來采用平板稀釋法計算細菌的存活率。計算方法同上。

1.2.5.4 耐膽鹽試驗 配置0.5%、0.4%、0.3%和0.2%豬膽鹽含量的LB培養(yǎng)基，分別取以上濃度的豬膽鹽培養(yǎng)基2.5ml到10ml的離心管中，每個管中分別加入2.5ml的細菌LB培養(yǎng)液，混勻，每個濃度重復(fù)3個，放到37℃的搖床中培養(yǎng)2h，然后取出來采用平板稀釋法計算細菌的存活率。計算方法同上。

1.2.5.5 抗致病菌活性測定 抗致病菌測定采用牛津杯法，致病菌使用實驗室保存的大腸桿菌和沙門氏菌。取150μl的大腸桿菌和沙門氏菌分別加到兩個LB平板上，用涂布器涂勻，將6個牛津杯均勻插到瓊脂里，每個牛津杯中加入芽孢桿菌菌液 200μl，置 37℃的培養(yǎng)箱中，培養(yǎng) 24h，測定抑菌圈的直徑。

1.2.5.6 產(chǎn)淀粉酶活力測定 采用平板透明圈法[6]，在溶解的100ml LB營養(yǎng)瓊脂中加入1g可溶性淀粉，121℃高壓滅菌15min，冷卻后倒板。將直徑6mm的空白藥敏紙片放到芽孢桿菌培養(yǎng)液中浸泡5min，然后貼到培養(yǎng)基上，每個平皿貼4片。放到 37℃的培養(yǎng)箱中，培養(yǎng)24h，取出培養(yǎng)皿，用吸管將革蘭氏染液加到平皿表面，恰好覆蓋就行。染色5min后，傾去染液，觀察貼紙片處的空白環(huán)直徑。求取平均值。

1.2.6 藥敏試驗 采用K-B紙片擴散法[7]，根據(jù)抑菌圈的大小判斷分離菌對抗生素的敏感性。將分離菌接種到液體LB培養(yǎng)基中，37℃搖床過夜。對培養(yǎng)后的細菌進行計數(shù)，并將細菌稀釋到1.0×108CFU/ml，吸取100μl稀釋后的菌液，加到營養(yǎng)瓊脂平板中，涂布器涂勻，靜置5min后，用鑷子將藥敏紙片貼于培養(yǎng)基表面，37℃培養(yǎng)過夜，用游標(biāo)卡尺測量抑菌環(huán)直徑。每種抗生素重復(fù)3次，計算平均值。抑菌環(huán)的大小根據(jù)《抗微生物藥物敏感性試驗規(guī)范》判斷細菌對藥物的敏感性效果。結(jié)果判定標(biāo)準(zhǔn)：抑菌圈直徑小于10mm不敏感，直徑在10～15mm之間中度敏感，直徑大于15mm敏感。

1.2.7 數(shù)據(jù)處理 數(shù)據(jù)處理用Excel統(tǒng)計分析數(shù)據(jù)，試驗結(jié)果用平均數(shù)±標(biāo)準(zhǔn)差表示。

2 結(jié)果

2.1 芽孢桿菌分離和純化 在營養(yǎng)瓊脂上分離到多株分離菌，然后通過連續(xù)劃線分離，分離到多個純化的菌落。通過初步的篩選，如菌落生長快速、形態(tài)特征好和生化性能符合要求等，選出一株優(yōu)秀的菌株。挑取篩選出的菌株進行擴增培養(yǎng)，用體積分?jǐn)?shù)為30%的甘油對其進行保藏，備用，進行進一步的研究。

2.2 芽孢桿菌的形態(tài)特征 分離菌在營養(yǎng)瓊脂上生長快速，菌落色暗，不透明，呈乳白色，形態(tài)不規(guī)則，表面有褶皺并向外擴散（圖1）。菌落涂片革蘭氏染色顯示，分離菌呈紫色桿狀，是革蘭氏陽性細菌（圖2）。分離菌在試管LB中生長，管底呈白色絮狀物，液面產(chǎn)生白色的菌膜。

圖1 芽孢桿菌菌落特征圖

圖2 芽孢桿菌革蘭氏染色陽性

2.3 芽孢桿菌的生化特征 對分離菌進行生化鑒定，試驗結(jié)果見表1。根據(jù)《伯杰細菌鑒定手冊》和《常見細菌系統(tǒng)鑒定手冊》，分離菌的染色特性、生化試驗和菌落形態(tài)特征，初步鑒定為枯草芽孢桿菌。

表1 菌株的生化特征

2.4 芽孢桿菌益生性研究

2.4.1 耐高溫試驗 分離菌在 60、70、80、90℃和100℃的水浴中10min后，進行計數(shù)，發(fā)現(xiàn)分離菌有一定的耐高溫作用，在80℃之前有較高的存活率，80℃的存活率是 （84±3.6）%， 但到了 90℃和100℃后，下降較快，100℃的存活率是（8±4.6）%，見圖3。

圖3 芽孢桿菌耐高溫試驗圖

2.4.2 耐酸試驗 分離菌在pH值調(diào)成2.0、3.0、4.0和5.0的培養(yǎng)基中生長2h后，進行計數(shù)，結(jié)果發(fā)現(xiàn)，隨著pH值的下降，分離菌的存活率也下降，見圖4，但是到pH2.0時，存活率還能達到（84±5.2）%。

圖4 芽孢桿菌耐酸試驗

2.4.3 耐膽汁試驗 分離菌接種到含0.5%、0.4%、0.3%和0.2%豬膽鹽的LB培養(yǎng)基中培養(yǎng)2h后，進行計數(shù)，結(jié)果顯示，隨著豬膽汁的濃度升高，分離菌的幸存率發(fā)生下降，但是，即使是濃度最高的0.5%的豬膽汁培養(yǎng)基，分離菌的幸存率還能達到（84±5.2）%。 見圖 5。

圖5 芽孢桿菌耐膽鹽試驗

2.4.4 抗致病菌活性測定 使用牛津杯法測定芽孢桿菌的抗致病菌試驗，結(jié)果顯示芽孢桿菌能夠抑制大腸桿菌和沙門氏菌的生長，對大腸桿菌的抑菌圈直徑為14.16±1.4mm，對沙門氏菌的抑菌圈直徑為11.58±2.3mm，說明分離菌具有一定的抑制病原菌的作用，大腸桿菌的效果略優(yōu)于沙門氏菌。

2.4.5 產(chǎn)淀粉酶活力測定 采用平板透明圈法測定分離菌的產(chǎn)淀粉酶活力測定，試驗結(jié)果顯示，浸泡過芽孢桿菌的濾紙周圍染色后出現(xiàn)透明圈，說明分離菌能夠產(chǎn)生淀粉酶，透明圈的直徑為13.58±1.4mm，說明分離菌具有產(chǎn)生淀粉酶的能力。

2.5 藥敏試驗結(jié)果 采用K-B紙片擴散法，測定分離菌對12種常用抗菌素的藥敏試驗，根據(jù)藥敏試驗獲得的藥敏環(huán)直徑大小判定分離菌對抗生素的敏感性，結(jié)果顯示，分離菌對土霉素和金霉素耐藥，對青霉素、鏈霉素、桿菌肽、丁胺卡那霉素和頭孢唑啉中度敏感，對慶大霉素、多粘菌素B、強力霉素、鏈霉素和紅霉素敏感。說明分離菌對試驗用抗生素大部分敏感，僅對少數(shù)抗生素耐藥。具體結(jié)果見表2。

3 討論

隨著食品安全和環(huán)境保護的監(jiān)控和要求越來越嚴(yán)格，抗生素飼料添加劑逐步退出市場。微生態(tài)制劑具有綠色、環(huán)保和生態(tài)的優(yōu)點。芽孢桿菌因為具有芽孢，能夠耐高溫、耐酸和方便保存，已經(jīng)被我國農(nóng)業(yè)部批準(zhǔn)為微生態(tài)飼料添加劑。一種好的微生態(tài)飼料添加劑必須從菌種抓起。要求菌種安全、有效和穩(wěn)定。而不同種屬來源的芽孢桿菌對宿主作用差異較大，因此，來源于本體動物的菌種最有優(yōu)勢[8]。因此，我們從肉雞的盲腸中分離到多株芽孢桿菌，并對其中一株在形態(tài)和生化鑒定比較典型的枯草芽孢桿菌進行益生性研究，評價其作為微生態(tài)菌種的潛在價值。

表2 菌株藥敏試驗結(jié)果

形態(tài)鑒定和生化試驗鑒定顯示分離的菌種符合枯草芽孢桿菌的特性。通過對其抗酸、抗鹽和耐高溫試驗研究，結(jié)果顯示分離菌在80℃以下、pH值2.0以上和膽鹽濃度0.3%以下存活率均能達到80%以上，符合飼料工藝和肉雞胃腸道的生理環(huán)境。對有害菌的抑制試驗也顯示，分離菌可以抑制大腸桿菌和沙門氏菌，并能產(chǎn)生一定的淀粉酶，可以起到對肉雞腸道的保健作用。分離菌藥敏試驗結(jié)果顯示，分離菌對大部分常見的抗生素敏感，但是對土霉素和金霉素耐藥，可能是肉雞飼料中長期添加土霉素或金霉素，導(dǎo)致分離菌耐藥。試驗結(jié)果也顯示分離菌對大部分抗生素中度敏感，而少數(shù)抗生素敏感，說明抗生素的大量使用造成分離菌的耐藥性問題很嚴(yán)重。作為益生菌的菌種要求對抗生素敏感，本試驗分離的益生菌基本符合要求。

試驗初步獲得了來源于肉雞腸道的一株枯草芽孢桿菌，菌種具有一定的益生功能，需要進一步的誘導(dǎo)和篩選，并通過動物實驗來確定菌種的價值。

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