韓亞力 羅 奕 曾佳學(xué)

(六盤水市人民醫(yī)院骨科，六盤水 553000)

骨質(zhì)疏松癥是臨床上較為常見的疾病之一，主要是以骨組織微結(jié)構(gòu)退化、以骨量減少為主要特征[1]。中藥骨碎補(bǔ)具有維持骨微結(jié)構(gòu)的完整程度和提高骨密度等作用[2]。骨碎補(bǔ)總黃酮(Davallia mariesil flavones,DMF)為骨碎補(bǔ)中的主要成分，但關(guān)于骨碎補(bǔ)總黃酮改善骨質(zhì)疏松的機(jī)制尚未可知。Notch信號通路中的多個(gè)信號分子參與多種疾病的發(fā)生和發(fā)展過程已被證實(shí)[3-5]，但是關(guān)于Notch信號通路中各個(gè)信號分子，包括受體Notch 1、Notch 3及下游靶基因Hes-1家族在骨質(zhì)疏松患者組織中的表達(dá)研究很少。本研究將探討DMF通過抑制Notch信號通路中Notch 1及下游靶基因Hes-1，緩解骨質(zhì)疏松癥狀的分子機(jī)制，期望為骨質(zhì)疏松治療探索新的治療靶點(diǎn)。

1 材料與方法

1.1材料

1.1.1臨床資料 選取2016年1月～2017年1月間我院收治的120例骨質(zhì)疏松患者作為研究對象。納入標(biāo)準(zhǔn)：①根據(jù)WHO推薦診斷標(biāo)準(zhǔn)確診為骨質(zhì)疏松；②體力狀況(Performance status，PS)評分0～2分，預(yù)計(jì)生存期>3個(gè)月。排除標(biāo)準(zhǔn)：①合并慢性感染性疾病、心肺功能障礙、惡性腫瘤者或其他重大疾病患者；②合并心理疾病、精神疾病患者。本研究采用回顧性分析的方法，把入選病例隨機(jī)分為試驗(yàn)組和對照組，每組60例，試驗(yàn)組60例，男29例，女31例，年齡40～86歲，平均(58.3±2.9)歲，體力狀況評分：0～1分40例，2分20例。對照組60例，男30例，女30例，年齡41～84歲，平均(56.9±3.1)歲，體力狀況評分：0～1分43例，2分17例。兩組患者的一般資料性別、年齡、體力狀況比較無明顯差異(P>0.05)，資料具有可比性。本研究通過我院倫理委員會(huì)審核，所有患者在治療前均知情同意。

1.1.2實(shí)驗(yàn)動(dòng)物 出生24 h的新生SD大鼠，1月齡SD大鼠，6月齡SD雌性大鼠(由中國科學(xué)院上海實(shí)驗(yàn)動(dòng)物中心提供)。

1.1.3實(shí)驗(yàn)藥物 強(qiáng)骨膠囊(成分為骨碎補(bǔ)總黃酮，davallia mariesil flavones，DMF)：國藥準(zhǔn)字Z20030007，北京岐黃制藥有限公司生產(chǎn)，規(guī)格：DMF 180 mg/粒。

1.1.4主要試劑和儀器 二甲基亞砜(DMSO)、四甲基偶氮唑藍(lán)(MTT)均購自Sigma公司；DMEM培養(yǎng)基、胎牛血清、胰蛋白酶均購自Gibco公司；Notch-1、Hes-1及GAPDH一抗均購自Cell Signaling Technology公司；二抗購自碧云天公司；Trizol試劑盒、逆轉(zhuǎn)錄試劑盒、PCR擴(kuò)增試劑盒均購自TaKaRa Bio公司；TNF-α、MCP-1、IL-6試劑盒均購自南京生物建成研究所。TGL-16G-A型高速冷凍離心機(jī)(上海安亭科學(xué)儀器廠)；7300型實(shí)時(shí)熒光定量PCR儀(美國Applied Biosystems公司)；基礎(chǔ)電泳儀(美國Bio-Rad公司)；酶標(biāo)儀(Thermo公司)；EL204-電子天平(上海特勒-托多利多儀器有限公司)；凝膠成像儀(美國Bio-Rad公司)；電泳儀(北京六一儀器廠)。

1.2方法

1.2.1治療方法 試驗(yàn)組用強(qiáng)骨膠囊(國藥準(zhǔn)字Z20030007，北京岐黃制藥有限公司生產(chǎn)，規(guī)格：DMF 180 mg/粒)聯(lián)合治療鈣爾奇D(惠氏一百宮制藥有限公司，維生素D 125 U/片，鈣600 mg/片)治療[6]。2粒/次，3次/日。對照組單純用鈣爾奇D(惠氏一百宮制藥有限公司，維生素D 125 U/片，鈣600 mg/片)治療。1片/次，1次/日。3個(gè)月為一個(gè)療程，使用2個(gè)療程。

1.2.2檢測指標(biāo) (1)臨床療效：骨質(zhì)疏松癥患者療效評價(jià)標(biāo)準(zhǔn)：無效：疼痛感無減輕，骨密度無改變；有效：腰背部存在輕度疼痛，骨密度提高；顯效：骨質(zhì)疏松癥狀消失，骨密度顯著提高。臨床總有效率=(顯效例數(shù)+有效例數(shù))/總例數(shù)×100%。(2)血鈣和血磷測定 采血，3 000 r/min離心5 min，分離上層血清，采用全自動(dòng)生化儀檢測血鈣、血磷。(3)炎癥因子指標(biāo)的測定：分別在用藥前后取患者血液于3 000 r/min離心10 min，分離血清，按各試劑盒說明書的要求測定炎癥因子TNF-α、MCP-1、IL-6含量。試劑盒均購自南京生物建成研究所。

1.2.3含藥血清的制備 將6月齡的SD大鼠，隨機(jī)分成2組：蒸餾水組和DMF組，每組12只。DMF組：按1 800 mg/kg體重進(jìn)行灌胃強(qiáng)骨膠囊懸液；蒸餾水組：按17.5 ml/kg體重進(jìn)行灌胃蒸餾水；2次/d，連續(xù)灌胃3 d。接著含藥血清制備方法參考文獻(xiàn)[7]。

1.2.4骨髓基質(zhì)細(xì)胞的分離與鑒定 取1月齡SD大鼠的股骨和脛骨，分離骨髓基質(zhì)細(xì)胞，分離和鑒定方法參考文獻(xiàn)[8]。

1.2.5RT-PCR檢測大鼠骨髓基質(zhì)細(xì)胞Notch-1、Hes-1 mRNA表達(dá)水平 采用Notch激活劑Jaggedl蛋白(1 000 μg/L)和抑制劑γ-分泌酶抑制劑(DAPT，16 μmol/L)，利用維甲酸(Retinoic acid，RA)建立骨質(zhì)疏松模型，探討DMF改善骨質(zhì)疏松的作用是否與Notch信號通路有關(guān)。取對數(shù)生長期的大鼠骨髓基質(zhì)細(xì)胞，以5×103ml-1濃度接種于6孔板，每組設(shè)置3個(gè)復(fù)孔。用含10%胎牛血清的〗DMEM培養(yǎng)基培養(yǎng)在37℃、5%CO2培養(yǎng)箱中培養(yǎng)24 h至貼壁，實(shí)驗(yàn)分組與給藥：①NC組：DMEM高糖完全培養(yǎng)液(含10% FBS)；②RA組：RA(0.4 mmol/L)；③DMF+RA組：DMEM高糖完全培養(yǎng)液(含DMF的血清)+RA(0.4 mmol/L)；④Jaggedl+RA組：Jaggedl[1 000 μg/L+RA(0.4 mmol/L)]；⑤Jaggedl+DMF+RA組：Jaggedl(1 000 μg/L)+DMEM高糖完全培養(yǎng)液(含DMF的血清)+RA(0.4 mmol/L)；⑥D(zhuǎn)APT+RA組：DAPT(16 μmol/L)+RA(0.4 mmol/L)；⑦DAPT+DMF+RA組：DAPT(16 μmol/L)+DMEM高糖完全培養(yǎng)液(含DMF的血清)+RA(0.4 mmol/L)。根據(jù)Trizol試劑盒提取組織總RNA，采用核酸測定儀測定RNA純度和濃度，取1 μg進(jìn)行逆轉(zhuǎn)錄，生成cDNA。采用SYBR green染料法進(jìn)行定量檢測，Notch-1、Hes-1及GAPDH(內(nèi)參)擴(kuò)增引物序列如表1，擴(kuò)增條件及計(jì)算方法參考文獻(xiàn)[9]。

1.2.6Western blot檢測大鼠骨髓基質(zhì)細(xì)胞Notch-1、Hes-1蛋白的表達(dá)水平 細(xì)胞培養(yǎng)與給藥方法同1.2.3項(xiàng)下，常規(guī)方法提取組織總蛋白，二喹啉甲酸(Bicinchoninic acid，BCA)方法測定蛋白質(zhì)含量后，進(jìn)行凝膠電泳，每孔上樣20 μg，電轉(zhuǎn)至聚偏氟乙烯薄膜(Polyvinylidene fluoride，PVDF)上后，3%的脫脂奶封閉2 h，分別孵育Notch-1、Hes-1(目的蛋白)和GAPDH(內(nèi)參蛋白)一抗，4℃孵育過夜，TBST洗膜，孵育二抗后顯影。采用Quantityone軟件對條帶亮度進(jìn)行分析。

1.2.7免疫組化檢測大鼠骨髓基質(zhì)細(xì)胞Notch-1、Hes-1蛋白的表達(dá)水平 采用常規(guī)方法制備5 μm厚的石蠟切片，進(jìn)行免疫組化染色，在10 mmol/L檸檬酸鹽緩沖液(pH6.0)的熱激30 min介導(dǎo)抗原復(fù)性，采用抗Notch-1、Hes-1單克隆抗體孵育，4℃過夜。洗滌后孵育二抗，加顯色液后進(jìn)行曝光。根據(jù)染色強(qiáng)度(0～3分，0分為無染色，1分為弱染色，2分為中度染色，3分為強(qiáng)染色)進(jìn)行判分。

2 結(jié)果

2.1臨床療效 試驗(yàn)組總有效率高于對照組總有效率(91.67%>76.67%)，P<0.05，具體見表2。

2.2兩組患者血鈣和血磷水平比較 兩組患者治療前血鈣和血磷水平比較差異無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P>0.05)；治療后，兩組患者血鈣和血磷水平較治療前均升高(P<0.05)；治療后，試驗(yàn)組血鈣和血磷水平高于對照組(P<0.05)，具體見表3。

2.3炎癥因子水平比較 兩組患者治療前TNF-α、MCP-1、IL-6水平比較差異無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P>0.05)；治療后兩組患者TNF-α、MCP-1、IL-6水平較治療前均降低(P<0.05)；治療后，試驗(yàn)組TNF-α、MCP-1、IL-6水平低于對照組(P<0.05)，具體見表4。

2.4RT-PCR檢測大鼠骨髓基質(zhì)細(xì)胞Notch-1、Hes-1 mRNA表達(dá)水平 與RA組相比，Jaggedl+RA組中Notch-1、Hes-1 mRNA水平均上調(diào)，DMF+RA組、DAPT+RA組中Notch-1、Hes-1 mRNA均下調(diào)，差異均具有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.05)。與Jaggedl+RA組相比，Jaggedl+DMF+RA組中Notch-1、Hes-1 mRNA水平均下調(diào)，差異均具有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.05)。與DAPT+RA組相比，DAPT+DMF+RA組中Notch-1、Hes-1 mRNA水平均下調(diào)，差異均具有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.05)。具體見表5。

2.5Western blot檢測大鼠骨髓基質(zhì)細(xì)胞Notch-1、Hes-1蛋白的表達(dá)水平 與RA組相比，Jaggedl+RA組中Notch-1、Hes-1 蛋白水平均上調(diào)，DMF+RA組、DAPT+RA組中Notch-1、Hes-1 蛋白均下調(diào)，差異均具有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.05)。與Jaggedl+RA組相比，Jaggedl+DMF+RA組中Notch-1、Hes-1 蛋白水平均下調(diào)，差異均具有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.05)。與DAPT+RA組相比，DAPT+DMF+RA組中Notch-1、Hes-1 蛋白水平均下調(diào)，差異均具有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.05)。具體結(jié)果表6、圖1。

表1RT-PCR引物設(shè)計(jì)

Tab.1RT-PCRprimerdesign

GeneForwardprimerReverseprimerNotch?15′?CTCCCCGTTCCAGCAGTCTC?3′5′?CAGCCACTCGCATTGACCAT?3′Hes?15′?AGGCGGCTAAGGTGTTTGGAGG?3′5′?GGCCGCTGGAAGGTGACACTG?3′GAPDH5′?ACCCATCACCATCTTCCAGGAG?3′5′?GAAGGGGCGGAGATGATGAC?3′

2.6免疫組化檢測大鼠骨髓基質(zhì)細(xì)胞Notch-1、Hes-1蛋白的表達(dá)水平 與RA組相比，Jaggedl+RA組中Notch-1、Hes-1 免疫組化評分均升高，DMF+RA組、DAPT+RA組中Notch-1、Hes-1免疫組化評分均下降，差異均具有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.05)。與Jaggedl+RA組相比，Jaggedl+DMF+RA組中Notch-1、Hes-1 免疫組化評分均下降，差異均具有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.05)。與DAPT+RA組相比，DAPT+DMF+RA組中Notch-1、Hes-1 免疫組化評分均下降，差異均具有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.05)。具體結(jié)果圖2、3,表7。

表2兩組患者臨床療效比較

Tab.2Comparisonclinicalefficacyoftwogroups

GroupsnExcellent[n(%)]Effective[n(%)]Invalid[n(%)]Totaleffectiverate(%)Experimentgroup6020(33 33)35(58 33)5(8 33)91 671)Controlgroup6016(26 67)30(50 00)14(23 33)76 67

Note：Compared with control group,1)P<0.05.

GroupsTimeBloodcalcium(mg/L)Bloodphosphorus(mg/L)ExperimentgroupBeforetreatment82 82±1 3131 82±0 83Aftertreatment118 22±1 551)2)67 98±0 351)2)ControlgroupBeforetreatment80 92±1 3331 78±0 93Aftertreatment100 81±1 561)51 38±0 131)

Note：Compared with before treatment,1)P<0.05;compared with control group,2)P<0.05.

GroupsTimeTNF?α(pg/ml)MCP?1(pg/ml)IL?6(pg/ml)ExprerimentgroupBeforetreatment182 82±1 31131 82±0 83141 82±0 83Aftertreatment108 22±1 551)2)57 98±0 351)2)67 98±0 351)2)ControlgroupBeforetreatment180 92±1 33131 78±0 93141 78±0 93Aftertreatment140 81±1 561)71 38±0 131)81 38±0 131)

Note：Compared with before treatment,1)P<0.05;compared with control group,2)P<0.05.

GroupsRelativemRNAlevelsNotch?1Hes?1NC0 99±0 040 99±0 02RA1 79±0 071)1 85±0 051)DMF+RA1 41±0 053)1 50±0 103)Jaggedl+RA1 97±0 032)1 98±0 062)DAPT+RA1 27±0 053)1 37±0 043)Jaggedl+DMF+RA1 61±0 054)1 78±0 034)DAPT+DMF+RA1 11±0 055)1 21±0 055)

Note：Compared with NC group,1)P<0.05;compared with RA group,2)P<0.05,3)P<0.01;compared with Jaggedl+RA group,4)P<0.05;compared with DAPT+RA group,5)P<0.05.

GroupsRelativeproteinlevelNotch?1Hes?1NC0 23±0 040 26±0 04RA0 67±0 111)0 70±0 061)DMF+RA0 45±0 083)0 48±0 033)Jaggedl+RA0 83±0 032)0 88±0 042)DAPT+RA0 35±0 043)0 40±0 053)Jaggedl+DMF+RA0 53±0 044)0 58±0 054)DAPT+DMF+RA0 28±0 045)0 31±0 045)

Note：Compared with NC group,1)P<0.05;compared with RA group,2)P<0.05,3)P<0.01;compared with Jaggedl+RA group,4)P<0.05;compared with DAPT+RA group,5)P<0.05.

圖1 Western blot檢測大鼠骨髓基質(zhì)細(xì)胞Notch-1、Hes-1蛋白的表達(dá)水平Fig.1 Western blot were performed to assess protein levels of Notch-1,Hes-1 in mice bone marrow stromal cells

圖2 免疫組化檢測大鼠骨髓基質(zhì)細(xì)胞Notch-1蛋白的表達(dá)水平Fig.2 Immunohistochemistry were performed to assess protein levels of Notch-1 in mice bone marrow stromal cells

3 討論

骨質(zhì)疏松癥是臨床上較為常見的疾病之一，其具有較高的發(fā)病率，主要是以骨組織微結(jié)構(gòu)退化、以骨量減少為主要特征。Notch信號通路參與多種疾病的發(fā)生和發(fā)展，其調(diào)控細(xì)胞多種進(jìn)程[10-12]。Notch-1、Notch-2、Notch-3和Notch-4是Notch受體，當(dāng)Notch配體與Notch受體特異性結(jié)合后，Notch信號通路隨后被激活，進(jìn)而激活下游靶基因Hes家族的轉(zhuǎn)錄[13]。Hes-1作為Notch信號通路下游靶基因Hes-1家族的主要成員，也隨之被激活[14-16]。目前，關(guān)于Notch信號通路中各個(gè)信號分子，包括受體Notch-1、Notch-3等及下游靶基因Hes-1家族在骨質(zhì)疏松組織中的表達(dá)研究較少，對此本文將進(jìn)一步探討。

圖3 免疫組化檢測大鼠骨髓基質(zhì)細(xì)胞Hes-1蛋白的表達(dá)水平Fig.3 Immunohistochemistry were performed to assess protein levels of Hes-1 in mice bone marrow stromal cells

GroupsScoreresultNotch?1Hes?1NC0 13±0 040 16±0 04RA2 67±0 111)2 70±0 061)DMF+RA1 95±0 083)1 98±0 033)Jaggedl+RA2 83±0 032)2 88±0 042)DAPT+RA1 35±0 043)1 40±0 053)Jaggedl+DMF+RA2 33±0 044)2 38±0 054)DAPT+DMF+RA0 48±0 045)0 51±0 045)

Note：Compared with NC group,1)P<0.05;compared with RA group,2)P<0.05,3)P<0.01;compared with Jaggedl+RA group,4)P<0.05;compared with DAPT+RA group,5)P<0.05.

臨床研究結(jié)果發(fā)現(xiàn)，DMF試驗(yàn)組總有效率高于對照組總有效率；治療后試驗(yàn)組血鈣和血磷水平高于對照組，而TNF-α、MCP-1和IL-6水平低于對照組。試驗(yàn)組Notch-1、Hes-1蛋白表達(dá)量低于對照組Notch-1、Hes-1蛋白表達(dá)量，結(jié)果提示骨碎補(bǔ)總黃酮可改善骨質(zhì)疏松癥，且其機(jī)制可能與Notch信號通路相關(guān)。接著在分離培養(yǎng)大鼠骨髓基質(zhì)細(xì)胞進(jìn)行體外實(shí)驗(yàn)研究，采用Notch激活劑Jaggedl和抑制劑DAPT，利用RA建立骨質(zhì)疏松模型，探討DMF改善骨質(zhì)疏松的作用是否與Notch信號通路有關(guān)。研究發(fā)現(xiàn)DMF同DAPT(Notch阻斷劑)一樣，可以下調(diào)RA所致的大鼠骨髓基質(zhì)細(xì)胞Notch-1、Hes-1 mRNA和蛋白水平升高。Jaggedl作為Notch激動(dòng)劑，可部分逆轉(zhuǎn)DMF對大鼠骨髓基質(zhì)細(xì)胞上述基因和蛋白的調(diào)控作用。

綜上所述，骨碎補(bǔ)總黃酮可改善骨質(zhì)疏松癥，且其機(jī)制可能與抑制Notch信號通路相關(guān)。

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