徐麗珊， 王利枝， 江震宇

(浙江師范大學(xué) 化學(xué)與生命科學(xué)學(xué)院,浙江 金華 321004)

佛手(CitrusmedicaL. Var.sarcodactylisSwingle)為蕓香科柑橘屬植物，是香櫞的變種，與檸檬、椪柑等有較近的親緣關(guān)系，主要分布在我國的浙江、四川、廣東、廣西和福建等地.近些年的研究表明，佛手不僅具有較高的欣賞價值，還具有較高的藥用價值，富含揮發(fā)油[1]、黃酮類[2]、多糖[3-4]、維生素和礦質(zhì)元素[5]等成分，具有抗氧化[6]、抗癌[7]、抗炎[8]、抑菌[9]、促胰島素分泌[10]及免疫調(diào)節(jié)[11]等生物活性.佛手果皮揮發(fā)油的香味獨(dú)特，還具有止咳平喘、疏肝理氣的功效[12]，且其抗氧化[6]、抑菌[13]、抗抑郁[14]和抗腫瘤[15]等活性已有文獻(xiàn)報道.

香櫞(CitrusmedicaL.)、檸檬(Citruslimon(L.) Burm. f.)和椪柑(CitrusreticulataBlanco cv. Ponkan)也屬于柑橘屬植物，其果實(shí)均含有氣味清新怡人的揮發(fā)油，從佛手、香櫞、檸檬和椪柑果皮中提取的揮發(fā)油是天然香料香精中的一大類.不同品種的柑橘類果皮揮發(fā)油其組成成分、香氣特征和功效上往往存在一定的差別，而佛手揮發(fā)油的主要成分與其他柑橘類果皮揮發(fā)油有哪些異同，是否具有類似的抗氧化和抗菌作用，目前還未見報道.黑曲霉和青霉是最常見的食物致腐真菌，而揮發(fā)油清除DPPH·能力是評價其抗氧化能力的最常用指標(biāo)，因此，本研究同時選取佛手及與佛手親緣關(guān)系較為接近的香櫞、檸檬、椪柑品種，比較佛手揮發(fā)油與這3種揮發(fā)油化學(xué)成分的不同及對黑曲霉和青霉菌的抑制和清除DPPH·活性能力的差異，進(jìn)一步推動佛手揮發(fā)油在食品保鮮劑、香料和醫(yī)用等方面的利用.

1 材料與方法

1.1 實(shí)驗(yàn)材料與儀器

材料：佛手、檸檬、椪柑和香櫞，均產(chǎn)自浙江省金華市；黑曲霉(Aspergillusniger)、青霉(Penicillium) 由浙江師范大學(xué)微生物學(xué)實(shí)驗(yàn)室提供； 1,1-二苯基-2-三硝基苯肼(DPPH·)購自美國Sigma公司.

儀器：島津UV-2550 紫外分光光度計(jì)；島津GCMS-QP2010氣質(zhì)聯(lián)用儀；Buchi R-210旋轉(zhuǎn)蒸發(fā)儀；BT224S型電子天平；MLS-3750型高壓蒸汽滅菌鍋；SW-CJ-1F型超凈工作臺；SPX-90B型恒溫生化培養(yǎng)箱.

1.2 實(shí)驗(yàn)方法

1.2.1 材料處理

佛手：取新鮮佛手果，準(zhǔn)確稱量切塊，以水作溶劑按照1∶3的料液比加水，打成漿狀.

香櫞、檸檬和椪柑：取新鮮果子，剝皮除去果囊，準(zhǔn)確稱量果皮切塊，以水作溶劑按照1∶3的料液比加水，打成漿狀.

1.2.2 精油的提取

分別取600 mL處理后的植物漿液，裝入1 L的提取瓶內(nèi)，采用水蒸氣蒸餾法蒸餾2 h.停止加熱后，待提取器中自然分層時，取出上層油狀物質(zhì)，加入適量無水硫酸鈉，靜止過夜，以除去揮發(fā)油中殘余水分.制得澄清揮發(fā)油液體，置于4 ℃冰箱避光冷藏待用.按式(1)計(jì)算揮發(fā)油得率.

(1)

1.2.3 揮發(fā)油氣相色譜-質(zhì)譜的分析條件

色譜柱條件：DB-1彈性石英毛細(xì)管柱(30 m×0.25 mm×0.25 μm)，載氣為氮?dú)?，程序升溫條件：初始溫度為40 ℃，保持3 min，以5 ℃/min的速率升至200 ℃，維持10 min.進(jìn)樣口溫度230 ℃，檢測器溫度250 ℃，分流比為100∶1，進(jìn)樣量1 μL.

質(zhì)譜條件：電離源為EI，電子能量70 eV；質(zhì)量掃描范圍30～600 amu，電子倍增器電壓1.5 kV，發(fā)射電流0.5 mA.

1.2.4 抑菌活性測定

以溶劑無水乙醇為空白對照，采用生長速率法[16]測定4種揮發(fā)油對黑曲霉和青霉的抑菌活性.并按式(2)計(jì)算抑菌率.

(2)

式(2)中：d0為對照組生長圈直徑；d1為實(shí)驗(yàn)組生長圈直徑；d2為菌餅直徑.

1.2.5 清除DPPH·能力測定[17]

取2 mL樣品液和2 mL DPPH·溶液(0.2 mol/L)于10 mL試管，混勻，避光靜置30 min，測517 nm 處吸光度值(Ai).以溶劑代替DPPH·溶液，同樣操作，測吸光度值(Aj)；以溶劑代替樣品液，同樣操作，測吸光度值(Ac).根據(jù)式(3)計(jì)算清除率.

(3)

1.2.6 統(tǒng)計(jì)學(xué)處理

所有實(shí)驗(yàn)重復(fù)3次以上，數(shù)據(jù)采用SPSS軟件和Design-Expert 8.05軟件分析，以平均值±標(biāo)準(zhǔn)差表示，P<0.01為差異極顯著，0.01≤P≤0.05為差異顯著，P>0.05為差異不顯著.

2 結(jié) 果

2.1 揮發(fā)油得率

用水蒸氣蒸餾法提取得到4 種呈澄清透明的淡黃色揮發(fā)油，揮發(fā)油得率由高到低的順序?yàn)闂崭?檸檬>佛手>香櫞，得率依次為(2.14±0.14)%，(1.42±0.19)%，(0.81±0.03)%，(0.18±0.03)%.柑橘類精油主要存在于果實(shí)外果皮的細(xì)小分泌腺中，而這4種果實(shí)的結(jié)構(gòu)不同，佛手沒有果囊，香櫞果皮中的白色內(nèi)皮相對較多，椪柑和檸檬果皮中外果皮所占比例大于內(nèi)果皮，這可能也是佛手揮發(fā)油得率低于椪柑和檸檬揮發(fā)油的原因.

2.2 揮發(fā)油成分類別及GC含量

4 種揮發(fā)油的GC-MS分析結(jié)果見圖1～圖4.結(jié)果顯示，佛手揮發(fā)油共分出40 個色譜峰，香櫞揮發(fā)油共分出44 個色譜峰，檸檬揮發(fā)油共分出36 個色譜峰，椪柑揮發(fā)油共分出27 個色譜峰.通過與數(shù)據(jù)庫標(biāo)準(zhǔn)圖譜進(jìn)行檢索，選取匹配度最高(>90)的圖譜作為該組分物質(zhì)，采用峰面積歸一化法計(jì)算各組分物質(zhì)的相對含量，各組分化合物名稱、分子式和相對含量如表1所示.

圖1 佛手揮發(fā)油總離子流色譜圖

圖2 香櫞揮發(fā)油總離子流色譜圖

圖3 檸檬揮發(fā)油總離子流色譜圖

圖4 椪柑揮發(fā)油總離子流色譜圖

由表1可知，佛手揮發(fā)油鑒定出40 個化合物，成分主要為烯烴類、醇類和醛類，主要化合物(相對面積>1%)有11 種，占總峰面積的93.77%.香櫞揮發(fā)油鑒定出44 個化合物，成分主要為烯烴類、醇類、醛類和酯類，主要化合物(相對面積>1%)有14 種，占總峰面積92.56%.檸檬揮發(fā)油鑒定出36 個化合物，成分主要為烯烴類、醇類、醛類和酯類，主要化合物(相對面積>1%)有14 種，占總峰面積93.58%.椪柑揮發(fā)油鑒定出27 個化合物，成分主要為烯烴類、醛類和醇類，主要化合物(相對面積>1%)有7 種，占總峰面積94.81%.

表1 4 種揮發(fā)油的化學(xué)成分及相對面積

續(xù)表1

續(xù)表1

注：-表示沒有檢測到.

2.3 4 種揮發(fā)油中揮發(fā)成分的比較

4 種揮發(fā)油的主要化學(xué)成分都是烯烴類，如d-檸檬烯、r-松油烯、蒎烯、月桂烯、a-萜品烯等，但含量有所不同，在佛手、香櫞、檸檬和椪柑揮發(fā)油中分別占87.29%，70.42%，79.24%和92.09%.佛手揮發(fā)油中鑒定出的主要成分是d-檸檬烯(53.70%)、r-松油烯(17.94%)和左旋-β-蒎烯(4.22%)，這一結(jié)果與金曉玲等[1]和趙磊等[18]研究中d-檸檬烯和r-松油烯是佛手揮發(fā)油主要成分的結(jié)果一致.香櫞揮發(fā)油的主要成分是d-檸檬烯(31.70%)、r-松油烯(22.09%)和鄰傘花烴(11.85%).檸檬揮發(fā)油的主要成分是d-檸檬烯(46.06%)、左旋-β-蒎烯(15.16%)、r-松油烯(9.41%).椪柑揮發(fā)油的主要成分是d-檸檬烯(73.89%)、r-松油烯(9.12%)、月桂烯(4.12%).因此，佛手和檸檬揮發(fā)油的主要成分都相同，含量不同；佛手和香櫞、椪柑揮發(fā)油中含量最高的2種成分都是d-檸檬烯和r-松油烯，含量有所不同.

4種揮發(fā)油中的共同成分有11種(至少一種揮發(fā)油的相對面積>1%)，分別為(2R,3R)-(-)-2,3-丁二醇、乙縮醛、3-崖柏烯、蒎烯、左旋-β-蒎烯、月桂烯、d-檸檬烯、(Z)-3,7-二甲基-1,3,6-十八烷三烯、r-松油烯、2-蒈烯、α-松油醇，分別占佛手、香櫞、檸檬和椪柑揮發(fā)油總峰面積的92.24%，76.45%，83.26%和96.33%.揮發(fā)油共有成分的相對含量見圖5.由圖5可知，(2R,3R)-(-)-2,3-丁二醇、乙縮醛和蒎烯這3 種化合物含量相差不多，而其余成分的含量差異較大，其中d-檸檬烯、r-松油烯和左旋-β-蒎烯這3 種化合物的含量相差最大且相對含量均較高.

佛手揮發(fā)油與香櫞揮發(fā)油相比，有14 種獨(dú)特成分被檢測出，占總含量1.78%，如4-萜烯醇(0.53%)、檸檬醛(0.18%)、1-異亞丙基-4-亞甲基-7-甲基-1,2,3,4,4a,5,6,8a-八氫萘(0.34%)等.佛手揮發(fā)油與檸檬揮發(fā)油相比，有15 種獨(dú)特成分被檢測出，占總含量1.76%，如香茅醛(0.12%)、4-萜烯醇(0.53%)和檸檬醛(0.18%)等.佛手揮發(fā)油與椪柑揮發(fā)油相比，有23 種獨(dú)特成分被檢測出，占總含量6.65%，如(3E)-羅勒烯(2.25%)、1-石竹烯(0.61%)、α-柏木烯(0.68%)和β-甜沒藥烯(0.98%)等.另外，佛手揮發(fā)油特有13 種成分，如4-萜烯醇、紫蘇醇、香茅醇、檸檬醛和香芹酚等，在香櫞、檸檬和椪柑揮發(fā)油中均未被檢測出來.

圖5 4 種揮發(fā)油中共同含有的揮發(fā)性成分

2.4 抑菌活性測定

4 種揮發(fā)油(10 mg/mL)對黑曲霉和青霉的抑制作用，結(jié)果見表 2.表2顯示，佛手、香櫞和檸檬揮發(fā)油對黑曲霉和青霉都有明顯的抑制生長作用，而椪柑揮發(fā)油對2種真菌有促進(jìn)生長的作用.佛手和香櫞揮發(fā)油對黑曲霉都有較強(qiáng)的抑制能力，且強(qiáng)于檸檬揮發(fā)油(P<0.05).而對青霉的抑制效果，香櫞和檸檬揮發(fā)油的抑制效果極顯著地高于佛手揮發(fā)油(P<0.01).因此,對同一種供試真菌，上述4 種精油的抑菌效果皆不同，可能是由于不同種揮發(fā)油具有不同的化學(xué)成分，才導(dǎo)致其抑菌活性不同.

表2 4 種揮發(fā)油對黑曲霉和青霉的抑制率 %

揮發(fā)油種類黑曲霉青霉佛手揮發(fā)油59.57±4.67a36.97±1.41b香櫞揮發(fā)油61.86±1.66a65.53±1.22a檸檬揮發(fā)油49.20±2.78b64.47±2.72a椪柑揮發(fā)油-29.98±5.91c-13.78±1.85c

注：對于同種菌指標(biāo)，同列中標(biāo)注不同角標(biāo)者具有顯著性差異(P<0.05).

2.5 清除DPPH·能力測定

4 種揮發(fā)油(20 mg/mL)及對照維生素E(20 mg/mL)的DPPH·清除能力結(jié)果見表3.表3顯示，佛手揮發(fā)油的DPPH·清除率顯著高于其他揮發(fā)油，說明佛手油有較強(qiáng)的DPPH·清除活性.香櫞揮發(fā)油與維生素E的DPPH·清除率不存在顯著差異。因此，香櫞揮發(fā)油也有較好的DPPH·清除能力.但相同濃度下，檸檬和椪柑揮發(fā)油對DPPH·清除活性顯著低于佛手和香櫞揮發(fā)油，表明這2種揮發(fā)油的DPPH·清除能力較弱.

表3 4 種揮發(fā)油對DPPH·的清除率 %

揮發(fā)油種類DPPH·清除率佛手揮發(fā)油77.50±0.22a香櫞揮發(fā)油62.84±0.31b檸檬揮發(fā)油5.34±0.06d椪柑揮發(fā)油14.57±0.00c維生素E61.51±0.03b

注：同列中標(biāo)注不同角標(biāo)者具有顯著性差異(P<0.05).

3 結(jié) 論

本試驗(yàn)采用水蒸氣蒸餾法提取佛手、香櫞、檸檬和椪柑果皮揮發(fā)油，對其成分進(jìn)行了GC-MS分析，并研究了其抑菌和抗氧化活性.結(jié)果鑒定出佛手、香櫞、檸檬和椪柑揮發(fā)油中的成分有烯烴類、醇類、醛類和酯類，主要化合物(相對面積>1%)分別為11，14，14和7 種，四者的相同成分有11 種(至少一種揮發(fā)油的相對面積>1%)，其中d-檸檬烯和r-松油烯既是4 種揮發(fā)油的主要成分也是共同成分.另外，佛手揮發(fā)油分別與香櫞、檸檬和椪柑揮發(fā)油相比，均含有一些獨(dú)特的成分，有13 種獨(dú)特成分在其余3種揮發(fā)油中均未被檢測出，且各成分的百分含量較少.已有研究表明,柑橘揮發(fā)油的主要成分對香氣的貢獻(xiàn)較小，而精油中占比例較小的醇類、醛類、酮類及酯類等含氧化合物是揮發(fā)油香味的主要來源[19].因此，推測佛手揮發(fā)油中這13 種獨(dú)特成分可能是佛手揮發(fā)油獨(dú)特香味的主要來源，這些獨(dú)特的揮發(fā)性成分可以作為鑒定及區(qū)分柑橘屬揮發(fā)油的輔助手段.

4 種揮發(fā)油的生物活性結(jié)果表明，佛手揮發(fā)油和香櫞揮發(fā)油對黑曲霉有較強(qiáng)的抑制活性；佛手揮發(fā)油對青霉有一定的抑制活性，但顯著弱于香櫞和檸檬揮發(fā)油；而椪柑揮發(fā)油對兩種菌都無抑制作用.另外，佛手揮發(fā)油還有顯著較強(qiáng)的清除DPPH·能力，其次是香櫞、椪柑和檸檬揮發(fā)油.因此,佛手、香櫞和檸檬揮發(fā)油具有相似的抑菌和清除DPPH·的能力，尤其佛手和香櫞揮發(fā)油的作用都相對較強(qiáng)，這無疑可以促進(jìn)佛手揮發(fā)油在食品保鮮劑、抑霉抗菌劑等方面的應(yīng)用.在實(shí)際應(yīng)用中還可以利用廉價的椪柑、香櫞、檸檬等柑橘屬揮發(fā)油，添加佛手揮發(fā)油的獨(dú)特?fù)]發(fā)性成分合成佛手揮發(fā)油，促進(jìn)佛手加工產(chǎn)業(yè)的發(fā)展，延長佛手產(chǎn)業(yè)鏈.

[1]金曉玲,徐麗珊,施瀟,等.4種佛手揮發(fā)油化學(xué)成分的研究[J].中國藥學(xué)雜志,2002,37(10):737-739.

[2]章斌,侯小楨,饒強(qiáng).響應(yīng)面優(yōu)化佛手總黃酮超聲提取及抗氧化研究[J].食品研究與開發(fā),2012,33(2):27-31.

[3]曹詣斌,朱海玲,王曉艷.不同產(chǎn)地佛手水溶性多糖的分離純化及初步分析[J].浙江師范大學(xué)學(xué)報：自然科學(xué)版,2008,31(2):190-194.

[4]He Z C,Liang F J,Zhang Y Y,et al.Water-soluble polysaccharides from finger citron fruits (CitrusmedicaL. var.sarcodactylis)[J].Carbohydrate Research,2014,388(3):100-104.

[5]金曉玲.金華佛手營養(yǎng)成分的分析[J].浙江師范大學(xué)學(xué)報：自然科學(xué)版,1998，21(4):86-88.

[6]Wu Z,Li H,Tu D W,et al.Extraction optimization,preliminary characterization,and in vitro antioxidant activities of crude polysaccharides from finger citron[J].Industrial Crops & Products,2013,44(2):145-151.

[7]Ma Y F,Shao L X,Zhang J P,et al.Effects of fingered citron essential oil on proliferation of MDA-MB-435 cells in vitro[J].Chinese Pharmaceutical Journal,2010,45(22):1737-1741.

[8]Kim K N,Ko Y J,Yang H M,et al.Anti-inflammatory effect of essential oil and its constituents from fingered citron (CitrusmedicaL. var.sarcodactylis) through blocking JNK,ERK and NF-κB signaling pathways in LPS-activated RAW 264.7 cells[J].Food & Chemical Toxicology An International Journal Published for the British Industrial Biological Research Association,2013,57:126-131.

[9]王建英,施長春,朱婉萍,等.金華佛手揮發(fā)油抗炎及急性毒性的實(shí)驗(yàn)研究[J].現(xiàn)代中藥研究與實(shí)踐,2004,18(2):46-48.

[10]Peng C H,Ker Y B,Weng C F,et al.Insulin secretagogue bioactivity of finger citron fruit (CitrusmedicaL. var.SarcodactylisHort,Rutaceae)[J].Journal of Agricultural & Food Chemistry,2009,57(19):8812-8819.

[11]徐曉虹,金曉玲,章子貴.金華佛手醇提液對小鼠記憶-耐力和免疫機(jī)能的影響[J].浙江師范大學(xué)學(xué)報：自然科學(xué)版,2000,23(2):180-182.

[12]施長春,王建英,朱婉萍,等.佛手揮發(fā)油對哮喘的治療作用[J].實(shí)用兒科臨床雜志,2010,25(4):287-288.

[13]郭衛(wèi)東,鄭建樹,鄧剛,等.佛手揮發(fā)油抑菌活性的研究[J].中國糧油學(xué)報,2009,24(8):103-107.

[14]高洪元,田青.佛手揮發(fā)油的抗抑郁作用機(jī)制探討[J].檢驗(yàn)醫(yī)學(xué)與臨床,2012,18(7):231-234.

[15]呂學(xué)維,邵鄰相,張均平,等.佛手揮發(fā)油對B16黑色素瘤細(xì)胞體外增殖的抑制作用[J].中國糧油學(xué)報,2011,26(8):50-54.

[16]凌丹燕,余路,梅葉.茶花和佛手膠孢炭疽菌對不同類型殺菌劑敏感性研究[J].浙江師范大學(xué)學(xué)報：自然科學(xué)版,2014,37(3):334-338.

[17]Islam F,Quadery T M,Sharmin R,et al.Antioxidant and cytotoxic activities ofMussaendamacrophylla[J].Bangladesh Pharmaceutical Journal,2012,15(1):69-71.

[18]趙磊,籍保平,周峰,等.十二種金華佛手揮發(fā)油成分的比較研究[J].食品科學(xué),2006,27(06):179-183.

[19]高余朵,李保國.柑橘精油的超臨界CO2萃取實(shí)驗(yàn)研究[J].上海理工大學(xué)學(xué)報,2005,27(3):207-210.