劉 靜

( 青島農(nóng)業(yè)大學(xué) 中心實(shí)驗(yàn)室，山東 青島 266109 )

雙殼貝類(lèi)免疫系統(tǒng)屬于非特異性免疫，由細(xì)胞免疫和體液免疫兩部分組成，血細(xì)胞可通過(guò)吞噬、包裹、形成結(jié)節(jié)等作用清除外源入侵物和病原生物，同時(shí)血細(xì)胞通過(guò)分泌一些抗菌肽、溶酶體酶等體液因子進(jìn)入血淋巴來(lái)完成體液免疫[1]，所以說(shuō)雙殼貝類(lèi)的血細(xì)胞既是細(xì)胞免疫的承擔(dān)者，也是體液免疫的提供者，在貝類(lèi)免疫防御體系中占很重要的地位。體外研究血細(xì)胞的形態(tài)、功能是了解其免疫活性的重要途徑，但雙殼貝類(lèi)血細(xì)胞離體后往往會(huì)出現(xiàn)凝集、甚至破裂，嚴(yán)重影響后續(xù)血細(xì)胞形態(tài)和功能的研究，因此適宜抗凝劑的篩選是研究雙殼貝類(lèi)血細(xì)胞免疫學(xué)的必要保障。

菲律賓蛤仔(Ruditapesphilippinarum)廣泛分布于我國(guó)南北沿海，且是較為重要的灘涂貝類(lèi)，目前關(guān)于菲律賓蛤仔血細(xì)胞的研究較少，已有文獻(xiàn)中各學(xué)者在獲取菲律賓蛤仔血細(xì)胞的描述中未提到使用抗凝劑[2-5]，但筆者在試驗(yàn)中發(fā)現(xiàn)菲律賓蛤仔血細(xì)胞離體后凝集嚴(yán)重，而目前尚無(wú)關(guān)于菲律賓蛤仔血淋巴抗凝劑的報(bào)道。理想的抗凝劑不僅能使血細(xì)胞不產(chǎn)生凝集現(xiàn)象, 而且能較好地保持細(xì)胞的形態(tài)完整和良好的功能[6]，筆者選取了10種不同抗凝劑配方，以菲律賓蛤仔血細(xì)胞的細(xì)胞形態(tài)、凝集程度作為衡量抗凝劑抗凝效果的評(píng)價(jià)指標(biāo)，初步找出抗凝效果好的抗凝劑，之后進(jìn)一步研究這些抗凝效果好的抗凝劑對(duì)菲律賓蛤仔血細(xì)胞存活率、血細(xì)胞組成、細(xì)胞凋亡率以及超微結(jié)構(gòu)的影響，進(jìn)而篩選出適合菲律賓蛤仔血細(xì)胞的抗凝劑，為今后開(kāi)展菲律賓蛤仔血細(xì)胞的相關(guān)研究提供基礎(chǔ)數(shù)據(jù)。

1 材料與方法

1.1 材料

1.1.1 試驗(yàn)動(dòng)物

菲律賓蛤仔購(gòu)自青島城陽(yáng)水產(chǎn)品批發(fā)市場(chǎng)，殼長(zhǎng)(3.52±1.97) cm，體質(zhì)量(8.23±0.197) g。買(mǎi)回的試驗(yàn)蛤仔暫養(yǎng)于塑料水箱中，水溫約16 ℃，每日早晚各換新鮮海水1次，暫養(yǎng)3 d后進(jìn)行試驗(yàn)。

1.1.2 血淋巴抗凝劑的種類(lèi)

根據(jù)現(xiàn)有文獻(xiàn)，筆者選取了貝類(lèi)常用的幾種抗凝劑來(lái)篩選適合菲律賓蛤仔血細(xì)胞的抗凝劑，配方見(jiàn)表1。

表1 10種不同抗凝劑的配方

注：以上緩沖液均使用超純水配置, 并用0.22 μm醋酸纖維素膜過(guò)濾除菌, 于4 ℃冰箱保存?zhèn)溆? 所有溶液均新鮮配制, 且低溫保存.0.1 mol/L磷酸鹽緩沖液: NaCl 28 g/L, KH2PO4 0.2 g/L，KCl 0.2 g/L，Na2HPO4·12H2O 2.9 g/L，pH 7.4.

1.2 試驗(yàn)方法

1.2.1 血淋巴的抽取

用無(wú)菌海水沖洗菲律賓蛤仔，用1 mL的無(wú)菌注射器先吸取0.3 mL上述不同的抗凝劑, 再?gòu)姆坡少e蛤仔閉殼肌處抽取0.3 mL血淋巴, 混合均勻后, 注入離心管中, 同時(shí)以不加抗凝劑的血淋巴為對(duì)照組，抽取的血淋巴放在冰上保存?zhèn)溆谩?/p>

1.2.2 抗凝劑作用下血細(xì)胞凝集團(tuán)個(gè)數(shù)及凝集細(xì)胞數(shù)的統(tǒng)計(jì)

獲取血淋巴后，分別于0、2、6 h在光鏡下觀察血細(xì)胞形態(tài)及凝集狀況，并隨機(jī)記錄0 h時(shí)有血細(xì)胞的40個(gè)視野中血細(xì)胞團(tuán)數(shù)和每團(tuán)的血細(xì)胞數(shù)量，每組抗凝劑重復(fù)3次試驗(yàn)。

1.2.3 抗凝劑對(duì)血細(xì)胞存活率的影響

選取抗凝效果較好的抗凝劑，檢測(cè)血細(xì)胞在各抗凝劑中6 h后細(xì)胞存活率。參照司徒鎮(zhèn)強(qiáng)等[17]的方法，取9滴血細(xì)胞懸液，加1滴0.4%臺(tái)盼藍(lán)染料，混勻，取10 μL血淋巴，滴在載玻片上，蓋上蓋玻片，在3 min內(nèi)顯微鏡下隨機(jī)記錄100個(gè)細(xì)胞中活細(xì)胞和死細(xì)胞數(shù)(藍(lán)色細(xì)胞為死亡細(xì)胞，成團(tuán)的細(xì)胞不計(jì)死亡率)，并根據(jù)下列公式求出細(xì)胞存活率。

血細(xì)胞存活率/%=活細(xì)胞數(shù)量/(活細(xì)胞數(shù)量+死細(xì)胞數(shù)量)×100%

1.2.4 抗凝劑對(duì)血細(xì)胞組成影響

根據(jù)細(xì)胞中顆粒的有無(wú)，可將菲律賓蛤仔血細(xì)胞分為顆粒細(xì)胞和透明細(xì)胞，在比較不同抗凝劑對(duì)血細(xì)胞組成影響時(shí)，以固定液(4%甲醛，2%NaCl，1%CaCl2)抽取的血細(xì)胞為對(duì)照組，光學(xué)顯微鏡下(Lecia DM500)隨機(jī)計(jì)數(shù)每個(gè)樣品中100個(gè)血細(xì)胞，計(jì)算出顆粒細(xì)胞和透明細(xì)胞所占比例。

顆粒細(xì)胞占比/%=顆粒細(xì)胞數(shù)/計(jì)數(shù)血細(xì)胞總數(shù)×100%

透明細(xì)胞占比/%=透明細(xì)胞數(shù)/計(jì)數(shù)血細(xì)胞總數(shù)×100%

1.2.5 抗凝劑對(duì)血細(xì)胞凋亡率的影響

采用吖啶橙/溴化乙啶法觀察血細(xì)胞凋亡，取50 μL細(xì)胞懸液，加入6 μL吖啶橙/溴化乙啶(100 μg/mL)熒光染色，混勻后，將細(xì)胞懸液滴加到載玻片上，加蓋玻片后于熒光顯微鏡下觀察。正常細(xì)胞的核質(zhì)著綠色，熒光深淺不一；凋亡早期血細(xì)胞，核內(nèi)染色質(zhì)發(fā)生不規(guī)則凝集、固縮和周邊化，可形成綠色致密濃染的顆粒狀、團(tuán)塊狀或半月?tīng)?；凋亡后期?xì)胞，染色質(zhì)塊固縮或碎裂形成凋亡小體，呈橘紅色；壞死的細(xì)胞核染色質(zhì)正常，被E·B染成橘紅色。每個(gè)樣品隨機(jī)計(jì)數(shù)100個(gè)細(xì)胞。

血細(xì)胞凋亡率/%=凋亡細(xì)胞數(shù)/計(jì)數(shù)的總血細(xì)胞數(shù)×100%

1.2.6 透射電鏡樣品制備[11-12]

用抗凝效果較好的抗凝劑抽取血細(xì)胞，6 h后用醛類(lèi)固定液(2%多聚甲醛-2.5%戊二醛，2%NaCl，2 mmol/L CaCl2，pH 7.4)4 ℃固定過(guò)夜，3000 r/min離心10 min，血細(xì)胞沉淀用2.5%的瓊脂預(yù)包埋后，0.1 mol/L二甲胂酸鈉緩沖液清洗血細(xì)胞，再用1%鋨酸后固定血細(xì)胞2 h，0.1 mol/L二甲胂酸鈉緩沖液清洗血細(xì)胞后，進(jìn)行丙酮梯度脫水，Spi-pon812環(huán)氧樹(shù)脂樹(shù)脂浸透包埋以及聚合，Leica UC7超薄切片機(jī)切片，切片厚70 nm，超薄切片經(jīng)醋酸鈾和檸檬酸鉛染液雙染色，日立HT7700型透射電鏡觀察并拍照，加速電壓80 kV。

1.2.7 掃描電鏡樣品制備

用抗凝效果較好的抗凝劑抽取血細(xì)胞，6 h時(shí)用醛類(lèi)固定液(2%多聚甲醛-2.5%戊二醛，2% NaCl，2 mmol/L CaCl2，pH 7.4)4 ℃固定過(guò)夜，取20 μL血細(xì)胞平鋪于蓋玻片上，之后鋨酸固定2 h，0.1 mol/L二甲胂酸鈉緩沖液清洗血細(xì)胞后，進(jìn)行丙酮梯度脫水，醋酸異戊酯置換、臨界點(diǎn)干燥(EmitechK850)、噴金處理，最后用JEOL 7500F掃描電鏡觀察并拍照。

1.2.8 數(shù)據(jù)的處理和分析

所有數(shù)據(jù)均以3個(gè)平行組數(shù)據(jù)的平均值±標(biāo)準(zhǔn)差表示，并采用單因素方差分析和Duncan檢驗(yàn)法統(tǒng)計(jì)分析。

2 試驗(yàn)結(jié)果

2.1 無(wú)抗凝劑條件下菲律賓蛤仔血細(xì)胞形態(tài)及凝集狀況

菲律賓蛤仔血細(xì)胞在無(wú)抗凝劑條件下伸出的微絲較多(圖1a)，細(xì)胞凝集嚴(yán)重(圖1b)；細(xì)胞貼壁能力強(qiáng)，20 min內(nèi)細(xì)胞快速貼壁，貼壁細(xì)胞微絲減少，逐漸形成偽足，細(xì)胞變大、成不規(guī)則狀(圖1c)。在無(wú)抗凝劑條件下，2 h后細(xì)胞均凝集加重，形成30～100 μm的較大凝集團(tuán)，6 h時(shí)細(xì)胞凝集越發(fā)嚴(yán)重，最大可形成270 μm的細(xì)胞團(tuán)(圖1d)。

2.2 不同抗凝劑對(duì)菲律賓蛤仔血細(xì)胞形態(tài)和凝集狀況的影響

抗凝劑1對(duì)菲律賓蛤仔血細(xì)胞具有較強(qiáng)的抗凝效果，血細(xì)胞分散較好，伸出的微絲較少(圖2a)，細(xì)胞凝集較輕，團(tuán)聚的血細(xì)胞松散而不緊密(圖2b)，但血細(xì)胞的貼壁能力變差；2 h內(nèi)凝集程度變化不是很大，但6 h后細(xì)胞凝集稍加重，形成少量30～60 μm的細(xì)胞凝集團(tuán)。

抗凝劑2中的血細(xì)胞凝集程度亦相對(duì)較低，但血細(xì)胞伸出的微絲較多(圖2c)，2 h后即形成30～90 μm不等的細(xì)胞團(tuán)，6 h即形成大至280 μm的細(xì)胞團(tuán)，并且100 μm以上的細(xì)胞團(tuán)占多數(shù)。

抗凝劑3對(duì)血細(xì)胞的抗凝效果稍差，多數(shù)細(xì)胞凝集成緊密的立體團(tuán)狀 (圖2d)，抗凝劑4抗凝效果稍好于抗凝劑3，但與抗凝劑3類(lèi)似，散在血細(xì)胞變形大，呈現(xiàn)出長(zhǎng)條形、多邊形、8字型等不規(guī)則形態(tài)(圖2e)。

抗凝劑5中血細(xì)胞伸出的微絲亦較多；抗凝劑6、7中的血細(xì)胞凝集成團(tuán)緊密，散在的細(xì)胞能快速貼壁，伸出偽足(圖2f)，2 h后細(xì)胞凝集形成30～200 μm的細(xì)胞團(tuán)，6 h后最大凝集團(tuán)直徑約達(dá)340 μm；抗凝劑8中血細(xì)胞凝集團(tuán)較多，最大的細(xì)胞凝集團(tuán)約105 μm，隨時(shí)間的延長(zhǎng)，凝集程度增加，2 h后最大的凝集團(tuán)的長(zhǎng)軸直徑約達(dá)255 μm。

抗凝劑9和抗凝劑10對(duì)菲律賓蛤仔血細(xì)胞的抗凝作用較好，6 h內(nèi)血細(xì)胞細(xì)胞分散，無(wú)凝集。抗凝劑9中的血細(xì)胞呈圓形，基本無(wú)微絲伸出，抗凝劑10中的血細(xì)胞周邊有泡狀結(jié)構(gòu)伸出。

圖1 無(wú)抗凝劑條件下菲律賓蛤仔血細(xì)胞形態(tài)及凝集狀況的觀察a、b放大倍數(shù)為40倍；c放大倍數(shù)為100倍；d放大倍數(shù)為10倍.

圖2 不同抗凝劑對(duì)菲律賓蛤仔血細(xì)胞形態(tài)及凝集程度的影響a～f放大倍數(shù)為40倍.

對(duì)無(wú)抗凝劑組與抗凝劑組中血細(xì)胞凝集團(tuán)個(gè)數(shù)進(jìn)行統(tǒng)計(jì)，抗凝劑1、抗凝劑2、抗凝劑9及抗凝劑10處理組血細(xì)胞成團(tuán)的數(shù)目顯著低于無(wú)抗凝劑組(P<0.05)(圖3)；從各抗凝劑組細(xì)胞團(tuán)中凝集細(xì)胞個(gè)數(shù)來(lái)看，抗凝劑1、抗凝劑9與抗凝劑10中凝集團(tuán)中含2～5個(gè)細(xì)胞的凝集團(tuán)占90%以上，表現(xiàn)出較好的抗凝效果(表2)。綜合凝集團(tuán)個(gè)數(shù)、凝集團(tuán)中血細(xì)胞的個(gè)數(shù)、凝集細(xì)胞間的緊密度及細(xì)胞形態(tài)，筆者選取的10種抗凝劑抗凝效果表現(xiàn)為抗凝劑9>抗凝劑10>抗凝劑1>抗凝劑2>抗凝4>抗凝劑7>抗凝劑3>抗凝劑8>抗凝劑6>抗凝劑5。

2.3 菲律賓蛤仔血細(xì)胞在抗凝劑1、抗凝劑9和抗凝劑10中6 h后成活率的研究

臺(tái)盼藍(lán)排斥法研究了菲律賓蛤仔血細(xì)胞在抗凝劑1、抗凝劑9以及抗凝劑10中6 h時(shí)的存活率，菲律賓蛤仔血細(xì)胞在3種抗凝劑中6 h內(nèi)存活率均在94.5%以上，并且各組之間無(wú)顯著性差異(P>0.05)(圖4)。

2.4 抗凝劑1、抗凝劑9、抗凝劑10對(duì)菲律賓蛤仔血細(xì)胞顆粒細(xì)胞和透明細(xì)胞數(shù)量的影響

為比較不同抗凝劑對(duì)血細(xì)胞組成的影響，選擇固定液組為對(duì)照組，試驗(yàn)結(jié)果見(jiàn)圖5，2 h內(nèi)抗凝劑1、抗凝劑9和抗凝劑10中顆粒細(xì)胞與透明細(xì)胞占比與對(duì)照組均無(wú)顯著差異(P>0.05)；6 h時(shí)抗凝劑1中顆粒細(xì)胞占比顯著增高(P<0.05)，而抗凝劑9和抗凝劑10中血細(xì)胞的顆粒細(xì)胞顯著下降(P<0.05)，相對(duì)應(yīng)抗凝劑1中透明細(xì)胞占比顯著降低，抗凝劑9與抗凝劑10中透明細(xì)胞占比顯著上升(P<0.05)。

圖3 無(wú)抗凝劑組和抗凝劑組中血細(xì)胞凝集團(tuán)個(gè)數(shù)的比較

圖4 菲律賓蛤仔血細(xì)胞在抗凝劑1、抗凝劑9與抗凝劑10中6 h時(shí)的存活率

圖5 抗凝劑1、抗凝劑9、抗凝劑10對(duì)菲律賓蛤仔血細(xì)胞顆粒細(xì)胞和透明細(xì)胞數(shù)量的影響

2.5 抗凝劑1、抗凝劑9、抗凝劑10對(duì)菲律賓蛤仔血細(xì)胞凋亡率的影響

用3種抗凝劑剛抽出的血細(xì)胞凋亡率無(wú)顯著差異(P>0.05)；2 h時(shí)抗凝劑1、抗凝劑9中血細(xì)胞凋亡率無(wú)明顯變化，而抗凝劑10中的血細(xì)胞凋亡率顯著上升(P<0.05)；6 h時(shí)抗凝劑1中血細(xì)胞凋亡率無(wú)顯著變化(P>0.05)，而抗凝劑9和抗凝劑10中的凋亡率顯著增加(P<0.05)，并且抗凝劑10中血細(xì)胞凋亡率顯著高于抗凝劑9中的凋亡率(P<0.05)(圖6)。

圖6 抗凝劑1、抗凝劑9、抗凝劑10對(duì)菲律賓蛤仔血細(xì)胞凋亡率的影響

2.6 透射電鏡和掃描電鏡下觀察血細(xì)胞形態(tài)結(jié)構(gòu)

掃描電鏡顯示無(wú)抗凝劑組菲律賓蛤仔血細(xì)胞易伸出大量微絲(圖7a)和偽足(圖7b)，而抗凝劑1中的血細(xì)胞表面結(jié)構(gòu)完整，伸出的微絲和偽足顯著減少(圖7c、7d)。透射電鏡顯示抗凝劑1中的血細(xì)胞整體結(jié)構(gòu)完好(圖7e)，線粒體、高爾基體等細(xì)胞器超微結(jié)構(gòu)保存較好(圖7f)。

圖7 掃描電鏡和透射電鏡下觀察血細(xì)胞形態(tài)結(jié)構(gòu)a、b：無(wú)抗凝劑組血細(xì)胞掃描電鏡圖；M：微絲；P：偽足；c、d：抗凝劑1中的血細(xì)胞的掃描電鏡圖；e、f：抗凝劑1中血細(xì)胞透射電鏡圖；N：細(xì)胞核；Mi：線粒體；G：高爾基體.

3 討 論

無(wú)脊椎動(dòng)物血液中的凝集素是免疫防御的重要體液因子之一，其在血細(xì)胞凝集、調(diào)理細(xì)胞吞噬、宿主與病原相互識(shí)別等方面發(fā)揮著重大的作用[18]。血細(xì)胞的凝集素已在多種貝類(lèi)血淋巴中提取，其中包括菲律賓蛤仔[19]。由于凝集素的凝集作用，菲律賓蛤仔血細(xì)胞在體外易發(fā)生凝集反應(yīng), 即使是低溫狀態(tài)也會(huì)在短時(shí)間內(nèi)形成凝集團(tuán)，類(lèi)似的現(xiàn)象在其他貝類(lèi)中已有報(bào)道[20], 故在抽取菲律賓蛤仔血淋巴時(shí)要立即加入抗凝劑。本試驗(yàn)選取的抗凝劑1～8以及抗凝劑10是目前有文獻(xiàn)報(bào)道的用于貝類(lèi)血細(xì)胞的抗凝劑，抗凝劑9是筆者根據(jù)其他抗凝劑的抗凝效果調(diào)整后的配方。試驗(yàn)結(jié)果表明，本試驗(yàn)所選10種抗凝劑對(duì)菲律賓蛤仔血細(xì)胞均具有一定的抗凝作用，其中抗凝效果較好的為抗凝劑1、抗凝劑9和抗凝劑10，這些抗凝劑在櫛孔扇貝(Chlamysfarreri)[7]、文蛤(Meretrixmeretrix)[21]和近江牡蠣(Crassostreaariakensis)[16]血細(xì)胞上也表現(xiàn)出理想的抗凝效果。

抗凝劑中檸檬酸鹽和乙二胺四乙酸均能與血液中的鈣離子結(jié)合，前者形成可溶性復(fù)合物，后者形成穩(wěn)定的螯合物，從而阻止血液凝固。比較抗凝劑6和抗凝劑7，抗凝劑7配方是抗凝劑6的基礎(chǔ)上加入了0.38%的檸檬酸鈉，而抗凝劑7的抗凝效果好于抗凝劑6，說(shuō)明檸檬酸鈉在一定程度上能抑制菲律賓蛤仔血細(xì)胞的凝集，但抗凝效果不顯著；抗凝劑2中檸檬酸鈉質(zhì)量濃度升至8.0 mg/mL時(shí)，抗凝效果顯著提高，但達(dá)不到完全抗凝的作用，這與張峰[6]發(fā)現(xiàn)低質(zhì)量濃度的檸檬酸鈉(3.8～5.4 mg/mL)對(duì)仿刺參(Apostichopusjaponicus)體腔細(xì)胞的抗凝效果不顯著，高質(zhì)量濃度檸檬酸鈉(7.6～11.4 mg/mL)則對(duì)體腔細(xì)胞的抗凝效果明顯的的結(jié)果相類(lèi)似。

比較抗凝劑2、抗凝劑3、抗凝劑4和抗凝劑9，其配方的差異主要在于乙二胺四乙酸含量的不同，其抗凝效果表現(xiàn)為抗凝劑9>抗凝劑2>抗凝劑4>抗凝劑3，說(shuō)明在檸檬酸鈉含量相同的條件下，乙二胺四乙酸含量升高，抗凝效果會(huì)提高。有學(xué)者發(fā)現(xiàn)當(dāng)乙二胺四乙酸的質(zhì)量濃度為2.0～3.0 mg/mL時(shí), 會(huì)減輕刺參體腔細(xì)胞凝集程度, 但細(xì)胞形態(tài)保持較差, 存活率降低[6]，而本試驗(yàn)選取抗凝劑1和抗凝劑9中乙二胺四乙酸的質(zhì)量濃度達(dá)到了5.845 mg/mL，6 h內(nèi)對(duì)菲律賓蛤仔血細(xì)胞的形態(tài)以及血細(xì)胞存活率均無(wú)影響，這可能跟物種差異有關(guān)。比較抗凝劑1、抗凝劑2與抗凝劑9的配方，抗凝劑1中不含有檸檬酸鈉，但乙二胺四乙酸的含量高于抗凝劑2，抗凝劑9是在抗凝劑2的基礎(chǔ)上，提高了乙二胺四乙酸的含量達(dá)到抗凝劑1的水平，抗凝效果表現(xiàn)為抗凝劑9>抗凝劑1>抗凝劑2，此結(jié)果說(shuō)明乙二胺四乙酸在菲律賓蛤仔血細(xì)胞抗凝作用中起著重要的作用，但乙二胺四乙酸含量也不是越高越好，抗凝劑10中乙二胺四乙酸的質(zhì)量濃度達(dá)到了15 mg/mL，雖然6 h內(nèi)細(xì)胞存活率無(wú)變化，但是2 h時(shí)就導(dǎo)致血細(xì)胞凋亡顯著升高，6 h時(shí)血細(xì)胞中顆粒細(xì)胞占比嚴(yán)重下降，說(shuō)明乙二胺四乙酸含量要控制在合適的范圍內(nèi)。

筆者通過(guò)比較血細(xì)胞在不同抗凝劑中的形態(tài)以及凝集程度，發(fā)現(xiàn)抗凝劑1、抗凝劑9和抗凝劑10的抗凝效果比其他抗凝劑好，比較這3種抗凝劑中血細(xì)胞在6 h內(nèi)的存活率、細(xì)胞組成比例以及凋亡率，結(jié)果表明，6 h內(nèi)3種抗凝劑對(duì)血細(xì)胞存活率均無(wú)顯著影響，但抗凝劑9、抗凝劑10在6 h時(shí)顯著降低了顆粒細(xì)胞的數(shù)量，并且顯著提高了血細(xì)胞的凋亡率，而抗凝劑1中血細(xì)胞除6 h顆粒細(xì)胞占比稍升高外，其余指標(biāo)6 h內(nèi)均無(wú)明顯變化。筆者發(fā)現(xiàn)6 h時(shí)抗凝劑1中血細(xì)胞有輕微凝集現(xiàn)象，并且凝集團(tuán)中透明細(xì)胞較多，故可認(rèn)為這是導(dǎo)致6 h時(shí)抗凝劑1中顆粒細(xì)胞占比升高的原因。利用掃描和透射電鏡對(duì)無(wú)抗凝劑組和抗凝劑1中6 h時(shí)的血細(xì)胞進(jìn)行表面和內(nèi)部超微結(jié)構(gòu)觀察，結(jié)果顯示無(wú)抗凝劑組的菲律賓蛤仔血細(xì)胞表面會(huì)放射出大量微絲，繼而變形形成偽足，這與孫虎山[22]利用掃面電鏡觀察櫛孔扇貝血細(xì)胞的表面結(jié)構(gòu)時(shí)得到的結(jié)果相類(lèi)似，而用抗凝劑1抽取的血細(xì)胞，細(xì)胞圓形，伸出的微絲和偽足顯著降低，并且血細(xì)胞內(nèi)部的超微結(jié)構(gòu)保存完好。

綜上所述，雖然抗凝劑1不是抗凝效果最好的抗凝劑，但綜合抗凝劑中血細(xì)胞形態(tài)、血細(xì)胞組成比例、細(xì)胞凋亡率以及血細(xì)胞的超微結(jié)構(gòu)等指標(biāo)，筆者認(rèn)為在選取的10種抗凝劑中，抗凝劑1是最適合作為菲律賓蛤仔血細(xì)胞的抗凝劑。此研究結(jié)果為今后利用菲律賓蛤仔血細(xì)胞開(kāi)展免疫學(xué)、毒理學(xué)等研究提供基本的技術(shù)支持和理論依據(jù)。

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