岳蒙蒙，趙金良

( 上海海洋大學(xué)，農(nóng)業(yè)部淡水水產(chǎn)種質(zhì)資源重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室，上海 201306 )

脊椎動(dòng)物雌、雄生長(zhǎng)差異受攝食、消化、生長(zhǎng)與生殖能量配置等影響[1]。魚類存在著兩性生長(zhǎng)差異現(xiàn)象，對(duì)鱖魚(Sinipercachuatsi)、羅非魚(Oreochromis)等研究發(fā)現(xiàn)，雌雄生長(zhǎng)差異出現(xiàn)與其性成熟時(shí)間相關(guān)[2-3]。尼羅羅非魚(O.niloticus)雄魚較雌魚生長(zhǎng)更快，且在性成熟時(shí)差異更加明顯，推測(cè)雌雄生長(zhǎng)差異受體內(nèi)性類固醇激素影響[4]。在羅非魚中發(fā)現(xiàn)，11-酮睪酮可通過提高攝食量使雄性迅速生長(zhǎng)。

腦腸肽是一類廣泛分布于中樞神經(jīng)系統(tǒng)和消化道的多肽，多由消化道分泌作用于下丘腦的攝食調(diào)節(jié)中樞，直接或間接參與攝食調(diào)節(jié)，主要分為攝食促進(jìn)作用和攝食抑制作用[6]。腦腸肽ghrelin是迄今發(fā)現(xiàn)的唯一一種具有攝食促進(jìn)作用的腦腸肽[5]，J?nsson等[7]發(fā)現(xiàn)不同喂養(yǎng)條件下虹鱒(Oncorhynchusmykiss)血清腦腸肽含量與進(jìn)食量呈正相關(guān)。Sakurai等[8]發(fā)現(xiàn)了與G蛋白偶聯(lián)的重要神經(jīng)肽食欲素，攝食狀態(tài)中尼羅羅非魚食欲素基因前體的表達(dá)量較攝食前、攝食后均有顯著性提高，預(yù)示食欲素可能作為攝食信號(hào)參與攝食調(diào)控[9]。神經(jīng)肽Y于1982年從豬腦中首次分離，屬于多肽家族，是一種內(nèi)源性促食欲因子[10]。饑餓使鯽魚(Carassiusauratus)、銀大麻哈魚(O.kisutch)腦中神經(jīng)肽mRNA表達(dá)量增加，重新投喂餌料后將產(chǎn)生相反影響[11-12]。1994年，從肥胖小鼠中克隆出OB基因，其編碼信號(hào)肽命名為瘦素，在金魚中外周和中樞注射瘦素均會(huì)降低攝食[13-14]。研究發(fā)現(xiàn)，草魚(Ctenopharyngodonidellus)、青鱸(Nibeajaponica)禁食后，膽囊收縮素基因表達(dá)量顯著降低，膽囊收縮素是攝食調(diào)控因子[15-16]。

攝食是魚類獲取營養(yǎng)和能量的唯一途徑，為個(gè)體存活、生長(zhǎng)、發(fā)育及繁殖提供物質(zhì)和能量基礎(chǔ)。魚類的攝食消化能力直接影響生長(zhǎng)速度，一般而言，攝食消化能力強(qiáng)則個(gè)體生長(zhǎng)較快。已有研究表明，金錢魚(Scatophagusargus)2齡以下雌性生長(zhǎng)快于雄魚，與其具有較高的攝食量、食物轉(zhuǎn)化率、蛋白酶和淀粉酶活性有關(guān)[17]；在灰海馬(Hippocampuserectus)中發(fā)現(xiàn)，相同飼養(yǎng)條件下，雌性蛋白酶、脂肪酶和淀粉酶顯著高于雄性，推測(cè)雌性需要更多能量用于性腺發(fā)育[18]。目前，關(guān)于性類固醇激素對(duì)雌雄尼羅羅非魚攝食基因及消化酶的研究未見報(bào)道，筆者通過測(cè)定雌雄尼羅羅非魚腦腸肽、瘦素、神經(jīng)肽Y、食欲素、膽囊收縮素mRNA表達(dá)量，結(jié)合淀粉酶、蛋白酶、脂肪酶活性，探究性類固醇激素對(duì)雌雄魚攝食消化的影響，為尼羅羅非魚養(yǎng)殖提供參考資料。

1 材料與方法

1.1 試驗(yàn)材料

尼羅羅非魚取自于上海海洋大學(xué)羅非魚種質(zhì)資源試驗(yàn)站，為新吉富羅非魚(O.niloticus)，全長(zhǎng)為(15.9±1.3) cm，體質(zhì)量為(62.2±13.1) g。運(yùn)回實(shí)驗(yàn)室后，在0.6 m×0.5 m×0.4 m室內(nèi)控溫循環(huán)水族箱中暫養(yǎng)兩周以適應(yīng)新環(huán)境，水溫(23±0.8) ℃。暫養(yǎng)期間日投喂兩次，分別為8：00、18：00，試驗(yàn)前12 h不投喂。

1.2 試驗(yàn)方法

雌雄試驗(yàn)魚分別分為3組，即雌二醇處理組、睪酮處理組和對(duì)照組，每組3個(gè)重復(fù)，每個(gè)重復(fù)5～6尾魚。雌二醇和睪酮均為美國Sigma公司產(chǎn)品，無水乙醇溶解后植物油稀釋(1∶10，體積比)后腹腔注射，劑量為50 μg/g，對(duì)照組僅注射無水乙醇∶植物油=1∶10(體積比)混合液。

注射后第6、12、24 h全部采樣，進(jìn)行生物學(xué)測(cè)定之后，置于冰盤上解剖，取出腦組織，于冰箱-80 ℃保存?zhèn)溆?；在冰上分離出胃、腸組織，清除脂肪和內(nèi)容物備用、剔除脂肪和結(jié)締組織。

1.2.1 胃、腸組織蛋白酶、淀粉酶、脂肪酶活性測(cè)定

胃、腸組織先用4 ℃冰凍蒸餾水沖洗干凈，濾紙吸干迅速稱量質(zhì)量并放入標(biāo)記管中，置于冰箱-80 ℃保存。取出樣本，分別加20倍4 ℃蒸餾水冰浴勻漿，勻漿液于冰箱4 ℃靜置1 h后，4 ℃，3000 r/min離心30 min，取上清液于冰箱4 ℃保存，24 h內(nèi)測(cè)定酶活力。

采用福林—酚試劑法測(cè)定蛋白酶活性，以37 ℃水浴15 min，每分鐘內(nèi)水解酪蛋白產(chǎn)生1 μg酪氨酸作為1個(gè)酶活力單位(U)。

淀粉酶活性測(cè)定以可溶性淀粉為底物，采用3，5-二肖基水楊酸顯色法，在pH 6.9和25 ℃條件下，每分鐘催化淀粉生成1 mg麥芽糖定為一個(gè)酶活力單位(U)[17]。

脂肪酶活力采用南京建成脂肪酶試劑盒測(cè)定。脂肪酶活性定義，1 g組織樣品在37 ℃測(cè)定條件下，每分鐘水解對(duì)硝基苯磷酸二鈉鹽產(chǎn)生1 μmol對(duì)硝基苯酚定義為1個(gè)酶活性單位(U)。

1.2.2 攝食相關(guān)基因相對(duì)表達(dá)

1.2.2.1 總RNA提取

使用CWBio公司Trizol試劑盒提取腦組織中總RNA，用1.5%瓊脂糖凝膠電泳檢測(cè)其完整性，用One DropTMSpectrophotometer測(cè)定總RNA純度及含量，-80 ℃低溫保存。

1.2.2.2 cDNA的合成

將總RNA稀釋至500 ng/μL，使用CWBio公司SuperRT cDNA Synthesis Kit進(jìn)行RT-PCR擴(kuò)增，具體操作按試劑盒說明進(jìn)行，反轉(zhuǎn)錄產(chǎn)物放入4 ℃冰箱保存。

1.2.2.3 引物設(shè)計(jì)

參照GenBank中羅非魚攝食相關(guān)基因腦腸肽、瘦素、食欲素、神經(jīng)肽Y、膽囊收縮素、β-actin cDNA序列，用Primer premier 5.0軟件設(shè)計(jì)各基因特異性引物(表1)，由生工生物工程(上海)有限公司合成。

表1 實(shí)時(shí)熒光定量PCR所用引物

1.2.2.4 實(shí)時(shí)熒光定量PCR擴(kuò)增

Real-time PCR擴(kuò)增參照UltraSYBR Mixture說明書進(jìn)行，擴(kuò)增程序?yàn)椋?5 ℃ 10 min; 95 ℃ 15 s，60 ℃ 1 min，40個(gè)循環(huán)；95 ℃ 15 s, 65～95 ℃熔解。所有樣品重復(fù)3次，根據(jù)結(jié)果調(diào)整擴(kuò)增反應(yīng)體系，使目的基因和內(nèi)參基因擴(kuò)增效率接近100%。用2-ΔΔCt法計(jì)算攝食基因mRNA相對(duì)表達(dá)水平[19]。

1.2.3 數(shù)據(jù)處理

所有數(shù)據(jù)均用Excel 2007軟件進(jìn)行分析，試驗(yàn)結(jié)果以平均值±標(biāo)準(zhǔn)差表示，使用SPSS 19.0軟件進(jìn)行差異顯著性分析，利用單因素方差分析法對(duì)數(shù)據(jù)進(jìn)行方差分析，差異顯著時(shí)用Duncan′s法多重比較，P<0.05為差異顯著。采用Sigma Plot 10.0制作圖表。

2 結(jié) 果

2.1 注射雌二醇、睪酮雌雄魚胃、腸道消化酶活性的影響

注射后12 h時(shí)，胃總蛋白酶活性最高，對(duì)照組雄魚胃蛋白酶活性顯著高于雌魚(P<0.05)，其他時(shí)間點(diǎn)雌、雄魚活性差異不明顯。外源性類固醇激素對(duì)雌、雄魚胃蛋白酶活力影響不明顯(P>0.05)(圖1)。

對(duì)照組雌、雄魚淀粉酶活性差異不明顯，12 h腸總淀粉酶活性最高。24 h體外注射睪酮顯著升高雄魚腸總淀粉酶活性，其他時(shí)間外源性類固醇激素對(duì)雌、雄魚腸總淀粉酶活力影響不明顯(P>0.05)，注射第12 h，腸總淀粉酶活性最高(圖2)。

12 h時(shí)，雄魚腸總脂肪酶活性顯著高于雌魚(P<0.05)，其他時(shí)間點(diǎn)雌、雄魚差異不明顯，12 h對(duì)照組雌、雄魚腸總脂肪酶活性最高。外源性類固醇激素對(duì)雌、雄魚腸總脂肪酶活力影響不明顯(P>0.05)(圖3)。

圖1 性類固醇激素對(duì)雌、雄尼羅羅非魚胃總蛋白酶活性的影響

圖3 性類固醇激素對(duì)雌、雄尼羅羅非魚腸總脂肪酶活性的影響

2.2 注射雌二醇、睪酮對(duì)攝食基因表達(dá)量的影響

2.2.1 腦腸肽mRNA

注射雌二醇、睪酮6 h后顯著升高雌魚腦腸肽mRNA水平(P<0.05)，雌二醇升高效果較睪酮更明顯;注射雌二醇、睪酮 6 h后，可快速、明顯的提高雄魚腦腸肽mRNA的表達(dá)(P<0.05)，睪酮升高效果較雌二醇更明顯，雌二醇、睪酮對(duì)雌、雄魚腦組織腦腸肽mRNA表達(dá)的作用顯示出明顯的性別二態(tài)性(圖4)。6、12、24 h隨時(shí)間推移，雌二醇對(duì)雌魚及睪酮對(duì)雄魚腦腸肽mRNA表達(dá)量的升高作用逐漸平緩。

圖4 性類固醇激素對(duì)雌、雄尼羅羅非魚腦組織腦腸肽mRNA水平的影響

2.2.2 瘦素mRNA

注射雌二醇6、24 h時(shí)顯著升高雌魚瘦素mRNA水平(P<0.05)，12 h影響不顯著(P>0.05)，注射睪酮顯著降低雌魚瘦素mRNA水平(P<0.05)；6 h雌二醇顯著升高雄魚瘦素mRNA水平(P<0.05)，而其他時(shí)間點(diǎn)影響不顯著，睪酮顯著降低雄魚瘦素mRNA水平(P<0.05)(圖5)。

2.2.3 食欲素mRNA

注射雌二醇12、24 h顯著升高雌魚食欲素mRNA(P<0.05)，對(duì)雄魚影響不明顯；相反，注射睪酮24 h時(shí)顯著升高雄魚食欲素mRNA(P<0.05)，對(duì)雌魚影響不明顯(圖6)。

2.2.4 神經(jīng)肽Y mRNA

性類固醇激素對(duì)尼羅羅非魚腦組織神經(jīng)肽Y mRNA表達(dá)的調(diào)節(jié)同樣存在雌雄差異性。注射雌二醇6 h后，明顯促進(jìn)雌魚神經(jīng)肽Y mRNA表達(dá)(P<0.05)，對(duì)雄魚表達(dá)影響不明顯；注射睪酮對(duì)雌、雄魚神經(jīng)肽Y mRNA表達(dá)影響不明顯，6 h后可顯著升高雄魚的表達(dá)，24 h進(jìn)一步上調(diào)腦組織神經(jīng)肽Y mRNA表達(dá)(圖7)。

2.2.5 膽囊收縮素mRNA

注射雌二醇6、12、24 h顯著降低雌魚膽囊收縮素mRNA表達(dá)量(P<0.05)，雌二醇對(duì)雄魚無顯著影響；睪酮對(duì)雌魚膽囊收縮素mRNA表達(dá)無顯著影響，6 h后顯著降低雄魚表達(dá)量。

圖5 性類固醇激素對(duì)雌、雄尼羅羅非魚腦組織瘦素mRNA 水平的影響

圖6 性類固醇激素對(duì)雌、雄尼羅羅非魚腦組織食欲素mRNA水平的影響

圖7 性類固醇激素對(duì)雌、雄尼羅羅非魚腦組織神經(jīng)肽Y mRNA 水平的影響

圖8 性類固醇激素對(duì)雌、雄尼羅羅非魚腦組織膽囊收縮素mRNA水平的影響

3 討 論

對(duì)脊椎動(dòng)物來說，攝食能力強(qiáng)則生長(zhǎng)更快。有研究發(fā)現(xiàn)，性類固醇激素參與調(diào)節(jié)攝食過程[1]。歐鱸(Percafluviatilis)雌魚較雄魚體長(zhǎng)更長(zhǎng)，雌、雄性別分化明顯，在同時(shí)升高雌、雄魚性類固醇激素水平時(shí)，食物攝食率降低[4]。在銀大麻哈魚、鯉魚(Cyprinuscarpio)、大鱗大麻哈魚(O.tschawytscha)的研究中發(fā)現(xiàn)，性類固醇激素升高，引起攝食量相應(yīng)升高[4]。

消化酶是消化系統(tǒng)分泌的具有催化食物分解的一類酶，其活性的強(qiáng)弱直接影響到魚類對(duì)營養(yǎng)物質(zhì)的消化吸收，進(jìn)而影響魚類生長(zhǎng)發(fā)育。本試驗(yàn)中，在消化能力方面即餌料效率，雄魚顯著高于雌魚，12 h對(duì)照組雄魚胃總蛋白酶、腸總脂肪酶活力較雌魚更高，可能是雄魚生長(zhǎng)快速需要更多能量，因此相應(yīng)升高消化酶活性來消化食物。除此之外，雄魚從外界獲取更多食物，這與前人研究結(jié)果一致，羅非魚雄魚較雌魚攝食量、消化管(胃、腸)、餌料效率、單位重量的攝食率更高[21]。本試驗(yàn)中，除了注射后12 h，睪酮顯著升高雄魚淀粉酶活性，其他時(shí)間性類固醇激素對(duì)消化酶活性影響不顯著，表明消化酶活性大小并不是性類固醇激素調(diào)節(jié)雌雄生長(zhǎng)的主要原因。

本試驗(yàn)中，對(duì)照組雌雄攝食基因腦腸肽、瘦素、食欲素、膽囊收縮素、神經(jīng)肽Y表達(dá)量隨時(shí)間變化不明顯，雌二醇和睪酮對(duì)雌、雄魚均表現(xiàn)出明顯調(diào)節(jié)作用，且這種調(diào)節(jié)作用對(duì)膽囊收縮素、腦腸肽、瘦素具有雌、雄差異性：雌二醇顯著升高雌魚、睪酮顯著升高雄魚腦腸肽表達(dá)量，6、24 h，雌二醇顯著降低雌魚、睪酮顯著降低雌雄魚瘦素表達(dá)量，性類固醇激素可通過調(diào)節(jié)外周抑制攝食因子瘦素、膽囊收縮素參與調(diào)節(jié)羅非魚食欲降低和能耗增加，這與已有研究結(jié)果一致。研究表明，對(duì)金魚(Carassiusauratus)中樞及外周注射腦腸肽，具有顯著促進(jìn)攝食和增加體質(zhì)量的作用[22]。荷那龍羅非魚(O.hornorum)饑餓4周后，饑餓組中胃組織腦腸肽基因表達(dá)量最高的個(gè)體較對(duì)照組表達(dá)量最低的個(gè)體增加了47.3倍[23]。魚類瘦素基因具有抑制攝食、控制體質(zhì)量的功能[24]。提示雌二醇、睪酮通過對(duì)腦腸肽、瘦素基因的調(diào)節(jié)，進(jìn)一步升高或降低攝食量，從而影響雌、雄生長(zhǎng)。

這些研究結(jié)果表明，性類固醇激素影響下，攝食調(diào)控因子相互作用，相應(yīng)調(diào)節(jié)魚體攝食機(jī)能及能量動(dòng)態(tài)平衡，進(jìn)一步可能影響羅非魚雌、雄生長(zhǎng)差異的產(chǎn)生。

[1] Johannsson G, Gibney J, Wolthers T, et al. Independent and combined effects of testosterone and growth hormone on extracellular water in hypopituitary men[J]. Journal of Clinical Endocrinology & Metabolism, 2005, 90(7):3989-3994.

[2] 王曉清, 李傳武, 謝中國,等. 鱖雌雄生長(zhǎng)差異的研究[J]. 淡水漁業(yè), 2006, 36(3):34-37.

[3] 岳蒙蒙, 趙金良, 唐首杰,等. 性成熟前期尼羅羅非魚雌雄性別生長(zhǎng)差異與性類固醇激素水平比較[J]. 浙江農(nóng)業(yè)學(xué)報(bào), 2016, 28(10):1678-1686.

[4] Mandiki S N M, Babiak I, Bopopi J M, et al. Effects of sex steroids and their inhibitors on endocrine parameters and gender growth differences in Eurasian perch (Percafluviatilis) juveniles[J]. Steroids, 2005,70(2):85-94.

[5] N?slund E, Hellstr?m P M. Appetite signaling: from gut peptides and enteric nerves to brain[J]. Physiology & Behavior, 2007, 92(1/2):256-262.

[6] 陳勇,李家樂,沈玉幫,等. 草魚ghrelin基因的分子克隆與組織分布及其攝食調(diào)控作用分析[J]. 水產(chǎn)學(xué)報(bào),2012,36(5):663-671.

[7] J?nsson E, Forsman A, Einarsdottir I E, et al. Plasma ghrelin levels in rainbow trout in response to fasting, feeding and food composition, and effects of ghrelin on voluntary food intake[J]. Comparative Biochemistry and Physiology - Part A Molecular & Integrative Physiology, 2007, 147(4):1116-1124.

[8] Silva E S D, Flores R A,Ribas A S, et al. Injections of the α 1 -adrenoceptor antagonist prazosin into the median raphe nucleus increase food intake and Fos expression in orexin neurons of free-feeding rats[J]. Behavioural Brain Research, 2017, 324(1):87.

[9] 陳文波, 王鑫, 周雅璐,等. 尼羅羅非魚Orexin前體基因的克隆、組織分布及其在攝食調(diào)控中的表達(dá)[J]. 動(dòng)物學(xué)研究, 2011, 32(3):285-292.

[10] Oliveira M M, Akerman S, Tavares I, et al. Neuropeptide Y inhibits the trigeminovascular pathway through NPY Y1 receptor: implications for migraine[J]. Pain, 2016, 157(8):1666.

[11] Kehoe A S,Volkoff H. Cloning and characterization of neuropepitide Y (NPY) and cocaine and amphetamine regulated transcript (CART) in Atlantic cod [J]. Comparative Biochemistry and Physiology, 2007,146(3):451-461.

[12] Peterson B C,Waldbieser G C, Riley L G, et al. Pre- and postprandial changes in orexigenic and anorexigenic factors in channel catfish [J]. General & Comparative Endocrinology, 2012, 176(2):231-239.

[13] Milaneschi Y, Lamers F, Bot M, et al. Leptin dysregulation is specifically associated with major depression with atypical features: evidence for a mechanism connecting obesity and depression[J]. Biological Psychiatry, 2015, 882(11):660-662.

[14] Tinoco A B, Nisembaum L G, Isorna E, et al. Leptins and leptin receptor expression in the goldfish (Carassiusauratus). Regulation by food intake and fasting/overfeeding conditions[J]. Peptides, 2012, 34(2):329-335.

[15] Feng K, Zhang G R, Wei K J, et al. Molecular characterization of cholecystokinin in grass carp (Ctenopharyngodonidellus): cloning, localization, developmental profile, and effect of fasting and refeeding on expression in the brain and intestine[J]. Fish Physiology & Biochemistry, 2012, 38(6):1825-1834.

[16] Babichuk N A, Volkoff H. Changes in expression of appetite-regulating hormones in the cunner (Tautogolabrusadspersus) during short-term fasting and winter torpor[J]. Physiology & Behavior, 2013, 120(5):54-63.

[17] 吳波, 葉滿, 陳孌孌,等. 不同性別養(yǎng)殖金錢魚生長(zhǎng)性能及消化酶活性的比較[J]. 上海海洋大學(xué)學(xué)報(bào), 2013, 22(4):545-551.

[18] 席寅峰, 張東, 施兆鴻. 投喂頻率對(duì)雌雄分化后灰海馬生長(zhǎng)發(fā)育、餌料轉(zhuǎn)換效率及消化酶活力的影響[J]. 海洋漁業(yè), 2013, 35(1):77-85.

[19] Faccini S, Mattia A D, Chiapponi C, et al. Development and evaluation of a new Real-Time RT-PCR assay for detection of proposed influenza D virus[J]. Journal of Virological Methods, 2017, 243(1):31-34.

[20] 袁登越. 齊口裂腹魚Leptin、CCK、PYY和CART基因的克隆、組織表達(dá)及攝食功能研究[D]. 雅安：四川農(nóng)業(yè)大學(xué), 2014.

[21] 馬細(xì)蘭, 張勇, 陳勇智,等. 性類固醇激素E2、MT對(duì)尼羅羅非魚(Oreochromisniloticus)雌、雄生長(zhǎng)差異的影響[J]. 海洋與湖沼, 2015, 46(6):1487-1493.

[22] Blanco A M,Bertucci J I, Sánchezbretao A, et al. Ghrelin modulates gene and protein expression of digestive enzymes in the intestine and hepatopancreas of goldfish (Carassiusauratus) via the GHS-R1a: possible roles of PLC/PKC and AC/PKA intracellular signaling pathways[J]. Molecular & Cellular Endocrinology, 2017(442):165-181.

[23] 高風(fēng)英,王歡,盧邁新,等. 荷那龍羅非魚ghrelincDNA的克隆及表達(dá)特征[J]. 華中農(nóng)業(yè)大學(xué)學(xué)報(bào),2010,29(6):752-757.

[24] De P N,Martínez-Alvarez R, Delgado M J. Acute and chronic leptin reduces food intake and body weight in goldfish (Carassiusauratus)[J]. Journal of Endocrinology, 2006, 188(3):513-520.

[25] Novak C M, Jiang X, Wang C, et al. Caloric restriction and physical activity in zebrafish (Daniorerio)[J]. Neuroscience Letters, 2005, 383(1/2):99-104.

[26] Campos V F,Robaldo R B, Deschamps J C, et al. Neuropeptide Y gene expression around meal time in the Brazilian flounderParalichthysorbignyanus[J]. Journal of Biosciences, 2012, 37(2):227-232.