蔣新龍 蔣益花 王純潔 朱志友 金文浩 沈佳琦

(浙江樹人大學生物與環(huán)境工程學院，杭州 310015)

石榴在我國大部分地區(qū)都有種植，石榴皮富含石榴多酚，但大部分都被丟棄。石榴多酚含有多個酚羥基，有較高的還原性，是一種天然無毒的抗氧化劑，具有抗氧化、抗衰老等多種生理和藥理活性[1-2]，但在光照、高溫等條件下容易被破壞，從而降低藥效且浪費資源。如何最大程度地保持石榴多酚的抗氧化能力、防止其自氧化，成為石榴多酚在食品、醫(yī)藥和日用化學品等領域廣泛應用的關鍵難題。

多孔淀粉是由淀粉經(jīng)人工方法處理而使顆粒呈現(xiàn)多孔狀，具較大的比表面積和吸附性能，可作為微膠囊芯材、吸附載體和包埋劑[3-4]。多孔淀粉對吸附質(zhì)起到類似于“包埋”的作用，可有效防止石榴多酚自氧化。本文選擇玉米多孔淀粉作為石榴多酚的吸附載體，研究多孔淀粉對石榴多酚的吸附工藝、吸附熱力學規(guī)律和吸附機理，并測定復合物的抗氧化活性，為多孔淀粉對石榴多酚抗氧化能力的保護作用提供參考。

1 材料與方法

1.1 材料與儀器

石榴皮：亳州典世堂藥業(yè)銷售有限公司；玉米淀粉：山東濟南市歷城區(qū)順鑫化工經(jīng)營部；α-淀粉酶(根據(jù)GB 8275—2009[5]方法測定α-淀粉酶酶活，測得α-淀粉酶酶活為1 698 IU/mL)、糖化酶(根據(jù)GB 8276—2006[6]方法測定糖化酶酶活，測得糖化酶酶活為1.19×104IU/g)：江蘇省奧谷生物科技有限公司；DPPH(1,1-二苯基-2-苦基肼)：上海源葉生物科技有限公司；其他試劑皆為分析純；所用水為蒸餾水。

UV-9100紫外可見光譜儀：北京瑞利公司；pHS-3B型精密pH計：上海精密科學儀器有限公司；ZHWY-110X往復式水浴恒溫培養(yǎng)振蕩器：江蘇盛藍儀器制造有限公司；電熱恒溫鼓風干燥箱：上海躍進醫(yī)療機械廠；300 kV高分辨透射電子顯微鏡(Tecnai G2 F30 S-Twin)：荷蘭Philips-FEI公司。

1.2 方法

1.2.1 多孔淀粉的制備

實驗利用復合酶-間歇超聲制備多孔淀粉。具體方法：1)將玉米淀粉原料分散到pH為5.0的檸檬酸和磷酸氫二鈉緩沖溶液，調(diào)制成質(zhì)量濃度為33.3%的淀粉乳A；2)預熱處理：將淀粉乳A移入到帶攪拌器和冷凝器收集裝置的密閉反應器內(nèi)，攪拌并加熱到55 ℃，保持15 min，淀粉顆粒受熱發(fā)生膨脹制得淀粉乳B；3)酶解處理：在淀粉乳B中加入0.4%的葡萄糖淀粉酶復合酶(糖化酶:α-淀粉酶9:1)，酶解10 h；其中，在酶解過程中進行間歇超聲處理30 min，每30 min處理1次；4)酶解終止處理：酶解結(jié)束后立即加入占緩沖液體積10%的NaOH溶液(4%)終止反應；5)酶解終止后處理：將物料用蒸餾水洗至中性并抽濾，然后60 ℃常壓干燥、粉碎過篩，控制含水量<12%，制得多孔淀粉產(chǎn)品。

1.2.2 石榴多酚的制備

采用微波法提取石榴皮多酚(簡稱石榴多酚)。精密稱取干燥、粉碎過80目篩的石榴皮粉末→微波醇提(微波功率288 W，乙醇體積濃度40%，料液比1:30 g/mL，提取時間40 s)→過濾→多酚樣品液。

1.2.3 多孔淀粉對石榴多酚吸附實驗

準確移取25 mL一定濃度的石榴多酚溶液于250 mL的三角燒瓶中，用0.1 mol/L HC1或NaOH調(diào)至預定pH值，加入一定量的多孔淀粉作為吸附劑，置于水浴振蕩培養(yǎng)器恒溫振蕩吸附一定時間后，過濾分離。采用Folin-Ciocalteu比色法(FC法)測定石榴多酚含量[7]。以多孔淀粉對石榴多酚的吸附量為衡量指標。

吸附量qe=(C0-Ce)V/M

式中：qe為平衡時在吸附劑上的吸附量/mg/g；V為溶液的體積/L；M為吸附劑的質(zhì)量/g；C0為初始質(zhì)量濃度/mg/L；Ce為吸附平衡時溶液中質(zhì)量濃度/mg/L。

1.2.4 多孔淀粉對石榴多酚吸附條件優(yōu)化實驗

單因素實驗：固定初始條件其他量不變，采用控制變量法，考量pH、吸附時間、吸附劑用量、石榴多酚初始質(zhì)量濃度、吸附溫度幾個因素，分別設置pH梯度1.0、2.0、30、4.0、5.0、6.0、7.0；吸附劑用量梯度10.0、15.0、20.0、25.0、30.0 mg/L；石榴多酚質(zhì)量濃度梯度為3.0、4.0、5.0、6.0、7.0 mg·mL-1；時間梯度為15、30、45、60、90、120 min；溫度梯度為30、35、40、45、50 ℃。測定多孔淀粉對石榴多酚的吸附量。

正交實驗優(yōu)化：參照單因素實驗以吸附劑用量、石榴多酚濃度、時間、pH為影響因素，進行四因素三水平正交實驗。吸附條件優(yōu)化的最終衡量標準是石榴多酚的吸附量，以石榴多酚吸附量最大時的條件為最優(yōu)吸附條件。分別選取pH為2、3、4；時間60、90、120 min；吸附劑用量10、20、30 mg/L；石榴多酚質(zhì)量分數(shù)5.0、6.0、7.0 mg/g。

1.2.5 吸附性能測定

在最優(yōu)吸附條件下進行實驗，將實驗數(shù)據(jù)分別用模型進行模擬，求得動力學參數(shù)、熱力學參數(shù)(ΔG0、ΔH0和ΔS0)及最大吸附量等吸附性能參數(shù)[8]。每個實驗重復3次。

1.2.6 多孔淀粉與石榴多酚復合物制備及抗氧化活性實驗

取一定量多孔淀粉在最佳吸附條件下吸附石榴多酚，冷凍干燥后制得復合物，采用Folin-Ciocalteu比色法[7]測得石榴多酚含量為3.808 mg/g。

DPPH·法是用以評價天然抗氧化劑抗氧化活性的一種快速、簡便、靈敏可行的方法[9-10]。根據(jù)文獻[11]方法采用DPPH體系下清除自由基的方法，將石榴多酚和復合物分別置于24 ℃恒溫室內(nèi)自然光(平均光強3 000 lx)、強日光(平均光強85 000 lx)條件下進行光降解對照實驗。每隔1 d測定對DPPH·自由基的清除率，以對DPPH·自由基的清除率的保存率P(%)為衡量指標，監(jiān)測其抗氧化能力的變化。每個實驗處理均重復3次。清除率的保存率P=(Y0-Y)/Y0×100%，式中：Y0和Y分別為處理前后樣品對DPPH·自由基的清除率。

2 結(jié)果與分析

2.1 多孔淀粉的制備

從原玉米淀粉和多孔淀粉的掃描電鏡(SEM)成像分析結(jié)果(圖1)可以看出，原淀粉采用多孔化制備工藝后，在淀粉顆粒表面形成了大量的多孔結(jié)構(gòu)，且多孔的形成不僅僅是在淀粉表面，在淀粉的內(nèi)部也有孔隙形成，這樣的疏松多孔結(jié)構(gòu)，使比表面積明顯增大，從而顯著增大了對石榴多酚的吸附效果。

圖1 原玉米淀粉和多孔淀粉的掃描電鏡圖

2.2 多孔淀粉對石榴多酚吸附條件優(yōu)化

2.2.1 單因素實驗

由于石榴多酚在結(jié)構(gòu)上存在酚性羥基，在酸性條件下比較穩(wěn)定。圖2可知，當pH<7時，隨著pH值的增大，多孔淀粉對石榴多酚的吸附量逐漸減小；隨著多孔淀粉用量的不斷增加，加大了吸附表面積，同時也增加了參與吸附的位點，但單位多孔淀粉的吸附量在不斷減?。浑S著吸附時間和石榴多酚濃度的不斷增加，多孔淀粉對石榴多酚的吸附量也逐漸增大直至達到吸附飽和。由圖2可知，當吸附溫度為40 ℃時吸附量最大，但與30 ℃水平差異不顯著，所以吸附溫度固定為30 ℃。

圖2 多孔淀粉對石榴多酚吸附單因子實驗

2.2.2 正交實驗

根據(jù)單因子實驗結(jié)果，采用L9(34)正交實驗設計表頭，對其中主要因子pH值(A)、吸附時間(B)、吸附劑用量(C)、石榴多酚初始質(zhì)量濃度(D)4因子在3個不同水平進行優(yōu)選。實驗結(jié)果見表1。

表1 正交實驗結(jié)果

表2 方差分析表

注：F0.01(2、2)=99.00，“**”表示因素影響極顯著。

結(jié)果采用直觀分析和方差分析，以得出多孔淀粉對石榴多酚的最佳吸附條件。表1中K1、K2、K3為每個因素3次實驗所得的吸附量的平均值。R為平均數(shù)的極差，R越大表明變化幅度大，說明該因素的水平變化對吸附量的影響越大，該因素即是最大影響因素。由表1可知，影響吸附量的因素主次依次排列為：吸附劑用量>初始質(zhì)量濃度>pH值>吸附時間。由表2可知吸附劑用量對吸附量的影響極顯著，其他因素對吸附量的影響則不顯著。直觀分析，實驗的最優(yōu)水平組合為A1B1C1D1；根據(jù)每個因素K1、K2、K3，實驗的最優(yōu)水平組合為A1B2C1D1。吸附時間對吸附量的影響不顯著且最小，綜合正交實驗分析結(jié)果，確定最佳工藝條件為A1B1C1D1，即吸附溫度30 ℃，pH值2，吸附時間1h，吸附劑用量10 g/L，初始質(zhì)量濃度5 000 mg/L。

2.3 吸附性能測定結(jié)果

2.3.1 吸附動力學性能

表3 動力學參數(shù)

2.3.2 吸附熱力學性能

吸附熱力學實驗目的在于通過研究吸附等溫線，確定多孔淀粉體對石榴多酚的最大吸附量及對石榴多酚的吸附熱力學特性。通常采用Langmuir吸附等溫吸附模型(Ce/q=1/KLqmax+Ce/qmax)和Freundlich吸附等溫吸附模型(lgqe=lgKF+lgCe/n)進行分析[8]。

根據(jù)優(yōu)化條件，將不同濃度石榴多酚溶液分別在30、40、50 ℃進行吸附實驗，模擬分析結(jié)果見表4。表中qmax為吸附劑最大吸附量，K、1/n為經(jīng)驗常數(shù)。由2個方程的線性相關系數(shù)r值可以判定2個方程都擬合良好，但更符合Freundlich吸附等溫吸附模型。多孔淀粉吸附石榴多酚的Langmuir方程擬合相關系數(shù)rL達到0.971 3～0.996 0，由此可推測多孔淀粉對石榴多酚的吸附為單層吸附。多孔淀粉吸附石榴多酚的Freundlich方程擬合相關系數(shù)rF為0.995 4～0.998 8，K為0.142 5～0.210 9，n為1.296 8～1.314 3，表明多孔淀粉對石榴多酚的吸附是自發(fā)吸附[12]。30、40、50 ℃時的最大吸附量分別可達到341.102 4、363.048 0、326.106 2 mg/g，優(yōu)于明膠微球等吸附材料[13-14]。

在以上等溫吸附模型中，可根據(jù)吸附等溫式常數(shù)K，計算吸附熱力學參數(shù)標準自由能變ΔG0、焓變ΔH0、熵變ΔS0及平衡平衡常數(shù)KC[8]。從表5可知，ΔG0、ΔH0均為負值，說明多孔淀粉吸附石榴多酚過程是自發(fā)的，而且是放熱的。ΔG0介于-29.73～-31.09 kJ/mol，而一般化學吸附的ΔG0介于-80～-400 kJ/mol，說明該過程主要是物理吸附作用。ΔH0為-9.17 kJ/mol，表明多孔淀粉對石榴多酚的吸附是弱放熱過程，而|ΔH0|<25 kJ/mol也說明了該吸附主要是物理過程。ΔS0值則說明吸附反應的進行增加了系統(tǒng)的混亂程度。

表4 吸附等溫線

表5 熱力學參數(shù)

2.4 多孔淀粉與石榴多酚復合物的抗氧化活性

多孔淀粉與石榴多酚復合物的人工光熱降解對照實驗結(jié)果見圖3。由圖3可知，石榴多酚的光降解與光照強度、光照持續(xù)時間等因素有關，光照強度越大、光照持續(xù)時間越長，抗氧化活性的保存率越低。相同光照強度和光照時間，低濃度石榴多酚復合物的抗氧化活性保存率比石榴多酚保存率高。

圖3 光照對抗氧化活性的保存率的影響

3 討論

通過正交實驗得到對吸附影響力順序從大到小排列為吸附劑用量>初始濃度>pH值>吸附時間。吸附劑用量對吸附量的影響極顯著，其他因素對吸附量的影響則不顯著。ΔH0為-9.17 kJ/mol，表明多孔淀粉對石榴多酚的吸附以物理吸附包埋、范德華力、靜電吸附為主。因為是自發(fā)的弱放熱過程，因此溫度對吸附的影響不顯著。由于石榴多酚在酸性條件下比較穩(wěn)定，在堿性條件易發(fā)生氧化聚合反應，但pH對弱放熱過程的物理吸附影響不明顯，pH在單因素實驗中可以觀察到，對石榴多酚吸附量的影響也不大，正交實驗對于pH的影響沒有顯著性。

一般情況下，一級吸附動力學方程通常只適用于吸附的初始階段，二級動力學模型是建立在整個吸附平衡時間范圍內(nèi)。研究表明吸附動力學行為同時符合一級反應動力學(R2>0.99)和二級反應動力學(R2>1.00)。但更符合二級反應動力學吸附模型。同樣，研究表明吸附過程同時符合Langmuir吸附規(guī)律(R2>0.94)和Freundlich吸附規(guī)律(R2>0.99)，但更符合Freundlich吸附等溫吸附模型。Langmuir模型的前提是假設固體表面是均勻的，為單層表面吸附；Freundlich吸附等溫式是基于吸附質(zhì)在多相表面上的吸附。由此可推測多孔淀粉對石榴多酚的吸附主要為多相表面上的吸附。Freundlich等溫線中n代表Fueundlich方程參數(shù)，并被Powell等[15]認為與吸附劑-吸附質(zhì)之間吸附推動力密切相關。計算求得n=1.30左右，表明多孔淀粉對石榴多酚的吸附較慢[16]。這與吸附時間在單因素實驗結(jié)果完全吻合。

對石榴多酚和復合物光降解對照實驗結(jié)果表明，在自然光下兩者差異不明顯，但在強光下5 d后，石榴多酚抗氧化活性保存率降低了5.83%，而石榴多酚與多孔淀粉復合物僅下降了3.53%。這說明多孔淀粉對石榴多酚的抗氧化活性有一定的保護作用，與駱慧敏等學者的研究結(jié)果一致[17-18]。

4 結(jié)論

通過四因素三水平正交實驗對多孔淀粉對石榴多酚的吸附條件進行優(yōu)化，得到吸附的最佳條件為：吸附時間60 min，吸附溫度30 ℃，溶液pH為2.0，石榴多酚質(zhì)量濃度為5.0 mg/mL。在該條件下，得到石榴多酚的實際最大吸附量為225.84 mg/g，與Langmuir等溫曲線擬合所得的理論最大吸附量341.10 mg·g-1有差異。主要原因在于正交實驗沒有考慮各影響因子的交互作用。

多孔淀粉對石榴多酚的吸附更符合Freundlich吸附等溫吸附模型，其動力學行為更符合二級反應速率方程。對表觀熱力學參數(shù)表明，其吸附主要是一個自發(fā)放熱的物理吸附過程。

人工光降解對照實驗表明，多孔淀粉在保護石榴多酚的抗氧化能力方面有較好的作用。

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