張 岱 張智猛 丁 紅 康 濤 宋文武 戴良香

(河北農(nóng)業(yè)大學植物保護學院1，保定 071001)(山東省花生研究所2，青島 266100)(泰安市農(nóng)業(yè)科學院3，泰安 271000)

花生是中國重要的經(jīng)濟和油料作物，其含蛋白質(zhì)24%～36%，其中90%為鹽溶性蛋白[1]，鹽溶性花生蛋白主要包括花生球蛋白(14S，類似于11S大豆球蛋白)、伴花生球蛋白Ⅱ(7.8S，類似于7S豌豆球蛋白)和伴花生球蛋白Ⅰ(2S)[2-3]?；ㄉ贩N的蛋白質(zhì)研究一直受到人們的重視，關(guān)于花生種子貯藏蛋白組成、籽仁發(fā)育過程中貯藏蛋白質(zhì)組成的變化，以及不同基因型花生的球蛋白亞基組成的研究均有報道，不同品種的蛋白質(zhì)組分和亞基含量存在較大差異，但由于花生基因型的差異，采用的方法和分類依據(jù)等的不同，結(jié)果不很一致[4-11]。有關(guān)花生種質(zhì)間蛋白亞基缺失研究表明，不同基因型缺失的蛋白亞基略有不同，Shokraii等[12]發(fā)現(xiàn)部分花生品種存在36 ku亞基的缺失，杜寅[13]則發(fā)現(xiàn)雙紀2號、粵油14號、閩花9號等25個品種35.5 ku亞基缺失，Liang等[14]發(fā)現(xiàn)蘭娜型花生中缺失35 ku亞基，西班牙型品種缺失27 ku。由于球蛋白對于花生的營養(yǎng)品質(zhì)和加工品質(zhì)影響作用較大，利用不同花生品種研究和了解我國花生種質(zhì)球蛋白的亞基組成與變異類型，對充分利用花生種質(zhì)資源，提高資源利用效率有非常重要的意義。本研究在對208份花生種質(zhì)資源的脂肪、粗蛋白質(zhì)、可溶性糖和淀粉等營養(yǎng)成分進行分析的基礎(chǔ)上，利用聚丙烯酰胺凝膠電泳(SDS-PAGE)技術(shù)，分析了其貯藏蛋白亞基組成，旨在探索我國花生品種資源中主要營養(yǎng)成分含量變化、蛋白亞基組成以及其相互間的關(guān)系，為花生種質(zhì)資源評價與鑒定提供參考，為推動優(yōu)質(zhì)花生蛋白資源的開發(fā)、提升花生蛋白產(chǎn)業(yè)整體效益提供借鑒。

1 材料與方法

1.1 供試品種與材料

選用來自全國各地的花生品種或品系208份，由山東省花生研究所種質(zhì)資源中期庫、濟寧市農(nóng)業(yè)科學院、河北農(nóng)業(yè)大學農(nóng)學院、河南省農(nóng)業(yè)科學院等提供(表1)。

實驗在山東省花生研究所實驗站進行，實驗地土壤類型為褐土，表層土壤質(zhì)地沙壤土，0～20 cm土壤肥力狀況：有機質(zhì)12.7 g/kg、水解N 89.3 mg/kg、速效P(P2O5)29.6 mg/kg、速效K(K2O)93.6 mg/kg。均于2012年5月8日播種，9月16日收獲。小區(qū)面積為32 m2，隨機排列，重復(fù)3次，穴播，行距40 cm，穴距18 cm，每穴2粒，常規(guī)田間管理。成熟后分小區(qū)收獲，晾干后分別選取有代表性飽滿莢果1 kg剝殼，籽仁備分析測定。

表1 供試花生品種及編號

1.2 測定指標與方法

脂肪含量的測定采用索氏法[15]，蛋白含量測定采用微量凱氏定氮法[16]，可溶性糖和淀粉含量的測定采用蒽酮比色法[15]。每份材料重復(fù)測定3次，取其平均值。

1.3蛋白組分SDS-聚丙烯酰胺凝膠電泳(SDS-PAGE)分析

采用BIO-RAD mini垂直板電泳槽進行SDS-PAGE分析。標準蛋白質(zhì)Marker采用中低分子量樣本，購自上海皓嘉科技發(fā)展有限公司。分離膠濃度為12%，濃縮膠濃度為5%。采用不連續(xù)緩沖系統(tǒng)，在內(nèi)槽加入負極電泳緩沖液，外槽加入正極電泳緩沖液，將20 μL樣品加入點樣孔。開始時電壓為15 V，待溴酚蘭完全到達分離膠與濃縮膠界面后，25 V恒壓電泳至結(jié)束。電泳后，考馬斯亮藍R-250染色液中染5 h，再在脫色液中脫色，直到背景脫干凈為止。用蒸餾水浸泡，至背景無色，拍照。

1.4 缺失亞基成分分析

切取亞基缺失對應(yīng)的譜帶，依次進行膠內(nèi)酶解(Trypsin，20 h)、抽提酶解肽段、ESI質(zhì)譜、軟件分析數(shù)據(jù)、鑒定蛋白質(zhì)。測試分析由中國科學院上海生命科學研究院生物化學與細胞生物學研究所蛋白質(zhì)研究分析中心進行分析。

1.4.1 毛細管高效液相色譜方法

色譜柱以95%的甲酸水溶液(0.1%)平衡后，樣品由自動進樣器上樣到Trap柱。

0～50 min，0.1%甲酸的乙腈水溶液(乙腈為84%)線性梯度從4%到50%；50～54 min，0.1%甲酸的乙腈水溶液(乙腈為84%)線性梯度從50%到100%；54～60 min，0.1%甲酸的乙腈水溶液(乙腈為84%)維持在100%。

1.4.2 主要參數(shù)

LTQ Velos質(zhì)譜儀(Thermo Finnigan,San Jose,CA)進行質(zhì)譜分析。進樣方式：Microspray，毛細管溫度：200 ℃，檢測方式：正離子，Trap柱：Zorbax 300SB-C18 peptide traps(Agilent Technologies,Wilmington,DE)，Column：0.15 mm×150 mm(RP-C18)(Column Technology Inc.)。

1.4.3 質(zhì)譜數(shù)據(jù)采集

多肽和多肽碎片的質(zhì)量電荷比按照下列方法采集：每次全掃描后采集20個碎片圖譜(MS2 scan)。

1.4.4 數(shù)據(jù)分析

原始文件用BIOWORKS軟件搜索相應(yīng)的數(shù)據(jù)庫。搜索使用Viridiplantae蛋白數(shù)據(jù)庫，最后得到鑒定的蛋白質(zhì)結(jié)果。

2 結(jié)果與分析

2.1 花生貯藏蛋白質(zhì)SDS-PAGE譜帶多樣性

條帶的粗細、染色的深淺度有較大差異，表明各個亞基的含量具有顯著變化。圖1示出48個品種的電泳譜帶，可以說明花生種質(zhì)資源或品種間貯藏蛋白電泳條帶數(shù)量的多樣性，表明花生蛋白種類和含量存在較高的多態(tài)性，品種間存在條帶缺失。圖1表明，各品種譜帶中的條帶數(shù)、各條帶的染色強度與面積存在很大差異。每個品種清晰可見的條帶為14～17條，平均為15條。各品種電泳譜帶均出現(xiàn)4條著色較深、面積較大的條帶，其余條帶均著色較淺，面積較小，這與不同類型貯藏蛋白的含量有關(guān)，但每個品種的清晰和不清晰的條帶均構(gòu)成了貯藏蛋白譜帶的連續(xù)性分布。花生貯藏蛋白電泳條帶的多樣性與品種中蛋白質(zhì)的多樣性有關(guān)，這可能是造成前人研究中因測試品種不同而獲得不同數(shù)量電泳條帶的主要原因。電泳條帶多樣性為改良花生蛋白質(zhì)構(gòu)成、培育加工專用品種創(chuàng)造了機遇。

注：a.自左至右依次為Mark、魯花11、魯花14、花育16號、花育17號、花育19號、花育20號、花育21號、花育22號、花育23號、花育24號、花育25號、花育27號；b.自左至右依次為Mark、花育28號、花育31號、花育32號、白沙1601、白花生、唐科8號、阜花10號、阜花11號、阜花13號、濰花6號、濰花8號、M5；c.自左至右依次為Mark1、Mark2、豐花5號、豫花15號、Z8、G2、H1、H3、Hx、16-8、16-9、HZ15、冀油1號、冀油2號；d.自左至右依次為豫花9號、豫花16號、海花1號、徐花5號、HLY3、HLY4、錦花5號、中花7號、粵油196、粵油35號、粵油79號、粵油26號、Mark。圖1 部分花生蛋白亞基組成SDS-PAGE電泳圖譜

2.2 花生蛋白質(zhì)條帶缺失

花生貯藏蛋白各亞基分子質(zhì)量在14.4～97.4 ku之間，17條譜帶相對分子質(zhì)量分別為97.4、66.2、55.5、43.0、40.6、37.4、34.2、32.6、31.0、26.8、25.6、23.5、22.8、21.5、20.1、17.5和14.4 ku，僅有分子質(zhì)量為66.2、40.6、37.4、34.2和22.8 ku的5條帶顏色深、面積大，其含量較高。同時，不同品種花生貯藏蛋白在34.2 ku處有明顯的條帶缺失，在26.8、25.6 ku處或表現(xiàn)條帶缺失或表現(xiàn)明顯的顏色、面積和含量差異。

對供試的208份花生品種(系)和種質(zhì)進行的SDS-PAGE分析結(jié)果表明，有45份材料在34.2 ku處有明顯的條帶缺失，占供試品種材料總數(shù)的21.65%，說明花生品種(系)和種質(zhì)資源的球蛋白組份存在著豐富的遺傳變異，花生品質(zhì)育種中優(yōu)良基因有著廣闊的選擇范圍。

2.3 花生主要營養(yǎng)品質(zhì)含量

表2表明，花生脂肪含量平均值為50.14 g/100 g，含量范圍在39.56～58.96 g/100 g間；蛋白質(zhì)含量平均值為27.6 g/100 g，含量范圍為22.19～33.19g/100 g，其變異系數(shù)最小，僅為6.73；品種(系)間可溶性糖含量差異較大，平均含量為9.33 g/100 g，其最高含量為20.53 g/100 g，最低僅為6.78 g/100 g，其變異系數(shù)為13.55；淀粉含量的最大值為16.3g/100 g，其變異系數(shù)最大為46.96。

在分析的208個品種(系)中，脂肪質(zhì)量分數(shù)超過55%的高油品種(系)有11個，分別為徐花5號(58.96 g/100 g)、HLY1(58.71 g/100 g)、HLY2(56.28 g/100 g)、HLY3(55.94 g/100 g)、HLY4(56.21 g/100 g)、HLY5(55.22 g/100 g)、HLN2(56.33 g/100 g)、HLL20(55.58 g/100 g)、金花1012(56.2 g/100 g)、E12(55.67 g/100 g)和遠育1808(55.24 g/100 g)，其占分析樣本的5.26%；高蛋白含量品種(粗蛋白質(zhì)含量大于32 g/100 g)僅有3個，分別為A021(33.19 g/100 g)、550GFA-1(33.17 g/100 g)和粵油26(32.13 g/100 g)；而高于30.0 g/100 g的品種達31個；可溶性糖高于20.0 g/100 g的品種(系)為2個，分別為紅皮花生和豫花15。

表2 花生籽仁主要營養(yǎng)成分含量/g/100 g

2.4 花生亞基缺失與品質(zhì)間的相關(guān)關(guān)系

表3表明，花生籽仁蛋白質(zhì)、脂肪、可溶性糖和淀粉含量各品質(zhì)指標間的相關(guān)關(guān)系不同，脂肪含量與蛋白質(zhì)和可溶性糖含量間均無明顯相關(guān)關(guān)系外，其余品質(zhì)指標間均存在顯著或極顯著的相關(guān)關(guān)系；且淀粉含量與蛋白質(zhì)、脂肪和可溶性糖間均表現(xiàn)極顯著的負相關(guān)關(guān)系，而可溶性糖與蛋白質(zhì)、脂肪含量間均表現(xiàn)正相關(guān)關(guān)系，脂肪與蛋白質(zhì)間表現(xiàn)不顯著的負相關(guān)關(guān)系。其中，淀粉和可溶性糖含量間的相關(guān)性最高，相關(guān)系數(shù)最大，達-0.741 5；其次為淀粉與蛋白質(zhì)含量間的相關(guān)關(guān)系，相關(guān)系數(shù)為-0.399 1；淀粉與脂肪含量間的相關(guān)系數(shù)為-0.334 8，蛋白質(zhì)與可溶性糖含量間呈極顯著的正相關(guān)，但其相關(guān)系數(shù)較小，為0.320。說明花生以蛋白質(zhì)含量為育種目標選育品種,可能保持較高的可溶性糖和淀粉含量。而在選育高脂肪含量的花生品種時,淀粉含量極顯著降低。

表3 花生品質(zhì)與條帶缺失間的相關(guān)關(guān)系

注：*和**分別表示相關(guān)性達1%和5%的顯著水平。

花生蛋白質(zhì)條帶缺失與籽仁品質(zhì)間的關(guān)系因指標不同而不同，除蛋白質(zhì)條帶缺失與淀粉含量間呈極顯著的正相關(guān)關(guān)系外，其余品質(zhì)指標與條帶缺失間均呈負相關(guān)關(guān)系，且可溶性糖與條帶缺失間的負相關(guān)關(guān)系達顯著水平。花生蛋白質(zhì)條帶缺失的品種淀粉含量較低，條帶缺失與淀粉含量間的相關(guān)系數(shù)為0.257 8，達極顯著水平，其與可溶性糖含量間的相關(guān)系數(shù)為-0.139 7，條帶缺失的品種可溶性淀粉含量相對較高。

2.5 缺失亞基功能分析

對所鑒定的蛋白質(zhì)通過數(shù)據(jù)庫檢索以及相關(guān)的文獻查詢，共檢測得到112個肽段，其中18個蛋白質(zhì)為可信蛋白(表4)。18個可信蛋白中的11個蛋白質(zhì)參與免疫調(diào)節(jié)過程，占可信蛋白的61%，4個蛋白參與氧化作用(22%)，1個蛋白質(zhì)參與信號傳遞(6%)，還有2個蛋白為其他或未知功能蛋白(11%)。

表4 蛋白鑒定結(jié)果和功能分類

3 結(jié)論

脂肪和蛋白質(zhì)是花生的主要營養(yǎng)成分，其質(zhì)量分數(shù)分別為39.56～58.96 g/100 g和22.19～33.19 g/100 g，平均值分別為50.14 g/100 g和27.6 g/100 g?；ㄉ讶手锌扇苄蕴呛偷矸酆科骄捣謩e為9.33 g/100 g和7.37 g/100 g，但其變異系數(shù)較大，分別為13.55和46.96?；ㄉ讶实矸酆颗c蛋白質(zhì)、脂肪和可溶性糖間均表現(xiàn)極顯著的負相關(guān)關(guān)系，可溶性糖與蛋白質(zhì)含量間呈極顯著的正相關(guān)而脂肪含量與蛋白質(zhì)和可溶性糖含量間均無明顯相關(guān)關(guān)系?？扇苄蕴呛偷矸酆渴怯绊懟ㄉ诟械闹匾蛩?，也是判別食用型花生主要指標，其含量高低對食用型花生品種培育與改良具有重要意義?；ㄉ缘鞍踪|(zhì)含量為育種目標選育品種,可能保持較高的可溶性糖和淀粉含量，在選育高脂肪含量的花生品種時,淀粉含量極顯著降低。

花生貯藏蛋白共有14～17條條帶，各亞基分子質(zhì)量在14.4～97.4 ku之間，僅有分子質(zhì)量為66.2、40.6、37.4、34.2和22.8 ku的5條帶顏色深、面積大，其含量較高，一些品種在34.2 ku處有明顯的條帶缺失，占供試品種材料總數(shù)的21.7%；在26.8、25.6 ku處或表現(xiàn)條帶缺失或表現(xiàn)明顯的顏色、面積和含量差異。對缺失蛋白亞基進行SHOTGUN測試，共檢測得到112個肽段，其中18個蛋白質(zhì)為可信蛋白，其功能涉及生物細胞代謝/能量代謝、免疫調(diào)節(jié)、信號傳遞等細胞過程。缺失蛋白涉及花生各個生長發(fā)育過程，可能與花生生物產(chǎn)量的提高和品質(zhì)的改善有密切關(guān)系。因此，篩選、培育優(yōu)良花生特定亞基缺失品種，深入研究花生蛋白組分及其不同亞基蛋白組的形成規(guī)律以及其營養(yǎng)和功能特性，可為表征花生品種的優(yōu)劣、優(yōu)良品種篩選、優(yōu)質(zhì)花生蛋白資源的開發(fā)，以及花生食品工業(yè)的發(fā)展提供參考。

[1]高煥春,李文英,呂曉玲.花生蛋白質(zhì)穩(wěn)定性及加工品工藝條件的研究[J].中外技術(shù)情報,1995(12):39-40

GAO H C,LI W Y,Lü X L.Study on protein stability of peanut and process conditions of processing[J].Chinese and Foreign Technical Information，1995(12):39-40

[2]黎茵,黃上志，傅家瑞.不同品種花生種子蛋白質(zhì)的電泳分析[J].植物學報,1998,40(6):534-541

LI Y,HUANG S Z,FU J R.One and two-dimensional polyacrylamide gel electrophoretic analysis of seed polypeptide composition of peanut cultivars[J].Acta Botanica Sinica,1998,40(6):534-541

[3]YAMADA T,AIBARA S,MORITA Y.Isolation and some properties of arachin subunits[J].Agricultural and Biological Chemistry,1979,43:2563-2568

[4]唐兆秀，徐日榮，藍新隆.南方珍珠豆型花生籽仁蛋白質(zhì)積累及亞基肽組分分析[J].中國農(nóng)學通報，2012,28(36):96-101

TANG Z X,XU R R,LAN X L.Protein Accumulation in the seed of southern spanish-type peanut and the analysis of subunit polypeptide component[J].Chinese Agricultural Science Bulletin，2012,28(36):96-101

[5]黃上志,傅家瑞.花生種子的發(fā)育與貯藏蛋白質(zhì)的合成和積累[J].植物生理學報,1992,18(2):142-150

HUANG S Z,FU J R.Development and accumulation of peanut seed development and storage protein[J].Acta Phytophysiologica Sinica,1992,18(2):142-150

[6]楊曉泉,張水華,黎茵,等.花生25蛋白的提取分離及部分性質(zhì)研究[J].華南理工大學學報(自然科學版),1998,26(4):1-5

YANG X Q,ZHANG S H,LI Y,et al.Extraction and separation of peanut 2S protein and its partial properties[J].Journal of South China University of Technology(Natural Science Edition),1998,26(4):1-5

[7]韋一能,陳元發(fā),陳國漢,等.花生蛋白質(zhì)的亞基組成及分子量研究[J].廣西師范大學學報:自然科學版,1998,16(1):71-78

WEI Y N,CHEN Y F,CHEN G H,et al.Study on subunit composition and molecular weight of peanut protein[J].Journal of Guangxi Normal University,1998,16(1):71-78

[8]廖斌,盧春斌,王蕾,等.花生種子發(fā)育和萌發(fā)過程中貯藏蛋白的合成和降解[J].植物生理與分子生物學學報,2004,30(1):115-118

LIAO B,LU C B,WANG L,et al.Synthesis and degradation of the peanut storage proteins during seed development and germination[J].Journal of Plant Physiology and Molecular Biology,2004,30(1):115-118

[9]戴良香,張岱,閆彩霞,等.不同花生品種籽仁發(fā)育過程中蛋白質(zhì)組分分析[J].中國糧油學報,2011,26(4):42-46

DAI L X,ZHANG D,YAN C X,et al.Peanut protein fractions during seed development for different varieties[J].Journal of the Chinese Cereals and Oils Association,2011,26(4):42-46

[10]KRISHNA T G,MITRA R.Arachin polymorphism in groundnut arachis hypogaea[J].Phytochemistry,1987,26(4):897-902.

[11]杜寅，王強，劉紅芝，等.不同品種花生蛋白主要組分及其亞基相對含量分析[J].食品科學，2013,34(9)：42-46

DU Y，WANG Q，LIU H Z,et al.Major protein fractions and subunit contents in peanut from different cultivars[J].Chinese Food Science，2013,34(9)：42-46

[12]SHOKRAII E H,ESEN A,MOZINGO R W.Relation of a 36,000 dalton arachin subunit to blanchability in peanuts(ArachishypogaeaL.)[J].Journal of Agricultural and Food Chemistry,1985,33(6):1114-1116

[13]杜寅.花生蛋白主要組分的制備及凝膠特性研究[D].北京:中國農(nóng)業(yè)科學院,2012:13-22

DU Y.Preparation of main components of peanut protein and study on its gel properties[D].Beijing:Chinese Academy of Agricultural Sciences,2012:13-22

[14]LIANG X Q,LUO M,HOLBROOK C C,et al.Storage protein profiles in Spanish and runner market type peanuts and potential markers[J].BMC Plant Biology,2006,6(24):1-9

[15]何照范.糧油籽粒品質(zhì)及其分析技術(shù)[M].北京:農(nóng)業(yè)出版社,1985

HE Z F.Grain and grain quality and its analytical techniques.Beijing:Agricultural Press,1985

[16]鮑士旦.土壤農(nóng)化分析(第三版).北京：中國農(nóng)業(yè)出版社,2000

BAO S D.Soil agrochemical analysis(The third edition)[M].Beijing:China Agricultural Publishing House,2000.