劉 欣 李 晶 魏玉玲 宋春滿 陳建華 繆恩銘 耿永勤 向 明 田麗梅

(云南中煙工業(yè)有限責任公司技術中心，云南 昆明 650231)

隨著煙草基因組計劃重大專項第2個五年計劃的開展，在未來5年，將以精準育種為核心，以突破品質為關鍵，著力實現(xiàn)從傳統(tǒng)育種手段向以工廠化育種、模塊化育種為主體的精準育種的跨越。其中基因編輯素材的篩選評價則是“優(yōu)質低害”煙草品種培育的重要技術手段。糖類物質是決定煙葉品質好壞的關鍵化學成分，對煙葉品質有著重要影響[1-2]，一直以來都是煙草化學檢測的重要項目[3-4]，也是國內外煙草行業(yè)的質量控制內容[5-6]。

糖的測定方法主要有比色法[7-9]、流動分析法[10-12]、光度法[13-14]、氣相色譜法(GC)[15-16]、毛細管電泳法(CE)[17-18]和高效液相色譜法(HPLC)[19-22]等。由于比色法、流動分析法和光度法只能測定糖的總量；GC法需要衍生化前處理，操作步驟復雜；液相色譜法由于前處理簡單，分離效率好，檢測靈敏度高，成為煙草糖類物質分析的重要分析手段，如煙草行業(yè)標準方法[23]。但是該方法色譜分析時間較長(>30 min)，前處理步驟較多，無法較好地滿足大量樣品的快速分析篩選評價需求，因此亟待開發(fā)快速分析方法及與之相匹配的前處理方法。

針對以上測定需求，本研究擬開展樣品前處理批量化改進處理研究，設計新型樣品萃取瓶，同時采用超高效液相色譜進行分離檢測，旨在為新鮮煙葉中4種糖類物質(果糖、葡萄糖、蔗糖、麥芽糖)提供準確可靠、操作簡單的快速篩選評估技術。

1 材料與方法

1.1 儀器設備與試劑

超高效液相色譜系統(tǒng)：ACQUITY UPLC型，配置ACQUITY蒸發(fā)光散射檢測器ELSD，美國Waters公司；

超純水處理系統(tǒng)：Milli-Q50型，美國Millipore公司；

電子分析天平：AE240型，精確0.000 1 g，美國Mettler公司；

超聲波振蕩器：SK5200型，上?？茖С晝x器有限公司；

D-果糖、D-葡萄糖、麥芽糖、蔗糖：純度>99%，美國Supelco公司；

甲醇、乙腈：色譜純，美國Fisher公司；

三乙胺：分析純，上海阿拉丁生化科技股份有限公司；

5個基因編輯煙草樣品：基因編輯育種工廠；

3個正常煙草樣品：云南中煙工業(yè)有限責任公司技術中心。

1.2 試驗方法

1.2.1 標準溶液配制 糖類物質(果糖、葡萄糖、麥芽糖、蔗糖)標準溶液：分別準確稱取0.5 g的果糖、葡萄糖、麥芽糖和蔗糖于100 mL的容量瓶中，用80%的甲醇水溶液溶解并定容到刻度，配制成濃度為5.0 mg/mL的4種糖物質的儲備液，于4 ℃下避光保存；使用時分別移取合適體積的儲備液，用80%甲醇稀釋成一系列所需濃度的標準工作液。

1.2.2 色譜分析條件 分析柱為ACQUITY UPLC BEH Amide 色譜柱(2.1 mm×100 mm，1.7 μm)；流動相為75%的乙腈(內含0.2% 三乙胺)，流速0.2 mL/min，柱溫35 ℃；進樣量5.0 μL；ELSD的漂移管溫度65 ℃，載氣為氮氣，載氣壓力241.32 kPa。

1.2.3 前處理方法

(1) 萃取瓶裝置：新型萃取瓶裝置主要解決適應于高通量分析的前處理技術，結構包含外套管(含密封圈)和內套管(帶0.45 μm過濾篩板)。進行樣品前處理時，樣品直接加入外套管中，加入萃取溶劑后利用密封圈將內套管固定在管口；進行樣品超聲處理后，直接壓入內套管，溶液通過篩板過濾和內套管相連接的彎管流出，使樣品過濾和轉移為一步，相較于平常前處理工作(利用注射器取樣，放置過濾頭，將濾液吸入注射器，過濾頭過濾，轉移溶液至色譜瓶的多步驟操作)具有較強的優(yōu)勢，可以大大提高前處理效率；另外可以避免操作人員的人為誤差，達到前處理的平行性和穩(wěn)定性。萃取瓶設計：實驗室前期設計了一種集樣品提取、過濾凈化和轉移裝瓶為一體，可以簡化操作步驟，保持樣品處理一致性的新型樣品萃取瓶，結構見圖1。

1. 樣品萃取外管 2. 樣品 3. 密封圈 4. 過濾篩板 5. 轉移彎管 6. 過濾內套管 7. 提取溶劑 8. 樣品收集瓶

(2) 前處理方法：基因編輯煙葉樣品，去除主干后，105 ℃ 殺青30 min，60 ℃恒溫烘干至恒重，粉碎；正常煙草樣品按YC/T 381—2010的方法制備。

將樣品萃取瓶的外套管固定在離心管架上，稱取0.25 g樣品到外套管中，加入25 mL的80%甲醇，然后把萃取瓶的內套管卡在外套管的口部，并利用密封圈進行固定，以防止萃取時萃取液的濺出。對外套管種的樣品進行超聲萃取，恒溫超聲35 min。

萃取完畢，取出裝置，直接下壓在瓶口處的內套管，萃取液直接通過內套管的篩板進行過濾，并進入到管內部，過濾的濾液從彎管管口直接流出，用色譜瓶直接進行收集即可供色譜進樣，操作一步實現(xiàn)樣品的過濾和轉移。

1.3 數據處理

數據采用Empower 2數據工作站進行處理。

2 結果與討論

2.1 樣品前處理條件

對煙草樣品中的糖一般采用水[24]、水—甲醇[25]、水—乙腈提取[22]，如果利用水來提取煙草，由于提取液中存在大量的酸性物質(如檸檬酸、酒石酸等)，會導致蔗糖發(fā)生水解，從而影響檢測的準確度[26]；據文獻[25]報道，采用含有甲醇的水溶液可以在一定程度上避免提取液中二糖和多糖發(fā)生水解反應，經試驗采用體積比為80%的甲醇水溶液為最優(yōu)條件。因此本試驗中不再優(yōu)化提取溶劑，直接采用文獻[25]優(yōu)化的提取溶劑比例。

考慮到加熱回流提取操作麻煩，所耗時間較長，不予采用；振蕩萃取和超聲萃取兩相比較，超聲萃取的效率更優(yōu)，因此本試驗中選用超聲萃取為最佳提取方式。

試驗表明，稱取0.25 g煙草樣品，加入80%的甲醇25 mL，超聲萃取30 min以上，煙草樣品中水溶性糖可提取完全(>98%)。因此本試驗中選擇用80%的甲醇超聲萃取35 min。

2.2 色譜條件優(yōu)化

ACQUITY UPLC BEH Amide氨基柱是糖類物質分析的常用色譜柱，根據試驗需要，選用水和乙腈作為流動相，隨著乙腈比例增大，4種糖類物質的峰型可以得到有效改善；試驗發(fā)現(xiàn)在流動相中添加三乙胺作為改進劑還可抑制色譜峰拖尾。試驗表明，用75%的乙腈(含0.2%的三乙胺)為流動相，等度洗脫即可讓待測組分達到基線分離。綜上所述，結合分離時間和分析效果，本試驗中優(yōu)選色譜分析條件為：75%的乙腈(含0.2%三乙胺)水溶液等度分離。

ELSD是糖類物質檢測的常用檢測器，由于糖類物質的非揮發(fā)性，經過ELSD會產生響應的信號，因此合適的載氣量和漂移管溫度是ELSD檢測器的關鍵優(yōu)化參數。載氣量的大小會影響霧化器中液滴的形成，影響ELSD檢測器的噪音和檢測靈敏度；漂移管溫度影響了流動相和檢測物質的氣化程度，會直接影響檢測效果和檢測限。通過信噪比比較和信號值對比，本研究優(yōu)選的檢測參數為：漂移管溫度65 ℃，氮氣作為載氣，壓力241.32 kPa。

2.3 方法線性關系，檢出限和定量限

利用優(yōu)化色譜條件進行分離，圖2為4種糖的標準溶液

色譜分析圖。從圖2可看出，4種糖類物質峰型較好，達到基線分離，分析時間大大縮短，與目前的煙草行業(yè)標準相比，每個樣品色譜分離時間縮短了3倍。

配制系列不同濃度的標準溶液，在選定色譜條件下進樣5 μL，根據測得的峰面積對糖的濃度(mg/mL)進行線性回歸，得到回歸方程，結果見表1。由表1中可以發(fā)現(xiàn)，4種糖類物質在5～250 μg/mL時具有較好的線性，線性相關系數均>0.999，檢測限為1.0～3.2 μg/mL，可以滿足煙草樣品中4種糖類物質的快速分析。

1. 果糖 2. 葡萄糖 3. 蔗糖 4. 麥芽糖圖2 4種糖標準溶液色譜圖Figure 2 The chromatogram of the standards

表1 4種糖的標準曲線方程、線性范圍、相關系數和檢出限?Table 1 Linear regression equations，correlation coefficients, detection limits and quantification limit of 4 analytes

2.4 方法驗證實驗

在需要考察的樣品中進行標準溶液添加(樣品含量的0.5，1.0，1.5倍)，進行加標回收率試驗，利用優(yōu)化的方法進行前處理，并按選擇的色譜條件進樣分析，每個樣品進行7次平行測定，4種糖的回收率為91.0%～102.0%，說明方法回收率較為理想，可以進行煙草中糖類物質的測定分析；考察方法的重復性(N=7)，4種糖類物質的日內精密度為1.2%～2.5%，日間精密度為2.0%～3.0%，綜上，方法重復性較佳，穩(wěn)定性較好，適合實際樣品檢測。

2.5 實際樣品分析

選取5個基因編輯煙葉樣品(1#為水培成苗期，2#為水培現(xiàn)蕾期，3#為水培開花期，4#為水培結實期，5#為水培病化煙苗)以及正常煙葉樣品3個(6#～8#)，按照優(yōu)化的前處理方法和色譜條件進行分離檢測，圖3為某水培成苗期新鮮煙葉實際樣品色譜圖。

從表2中可以發(fā)現(xiàn)，在苗期，煙株葉面較小，光合能力較弱，光合產物主要供應煙株生長發(fā)育，因此蔗糖等化合物基本處于累計狀態(tài)；成熟期，大量淀粉累計于煙葉，還原糖等急劇升高。而水培病化煙苗樣品(5#)，果糖和葡萄糖含量是異于同期的煙苗的(1#～4#)，可能是代謝通路出現(xiàn)差異后，導致碳氮代謝等基礎代謝發(fā)生變化，可以進行后續(xù)的深入分析。結果表明：利用建立的方法可以對煙苗期以及正常生長的新鮮煙葉中糖類物質進行分析檢測。方法前處理簡單易操作，分析時間大大縮短，容易實現(xiàn)批量分析，可以應用于大量基因編輯樣品篩選評價以及后續(xù)煙葉樣品的檢測分析。

1. 果糖 2. 葡萄糖 3. 蔗糖 4. 麥芽糖

表2 煙草樣品中4種糖的檢測結果Table 2 The results of the contents of 4 analytes in the real tobacco samples mg/g

3 結論

鑒于糖類物質對于煙草生長情況和品質的重要關系，本研究以基因編輯工廠化育種樣品為考察對象，以正常煙苗樣品為參照，立足于大量樣品快速分析的需求，針對目前方法存在的問題和缺點開發(fā)了一種新鮮煙葉中糖類化合物的快速檢測方法。結果表明：通過前處理裝置的研發(fā)和建立，可以大大簡化前處理步驟，提高前處理效率，并保證了樣品處理的穩(wěn)定性和平行性；利用超高效液相色譜分析，4種糖類物質能在10 min內達到基線分離，和行業(yè)標準相比色譜分析效率提高3倍，新建立的方法的精密度、回收率均可滿足煙草樣品分析的需求。下一步將進一步應用于煙草基因編輯工廠化育種的評價流程中，擴大樣本量的檢測，匯總數據，總結規(guī)律，為基因編輯功能研究提供重要數據支持和技術手段。