，

(安徽科技學(xué)院 生命與健康科學(xué)學(xué)院，安徽 鳳陽(yáng) 233100)

褪黑素(melatonin，MT)最早在1958年從牛松果體中分離得到的一種短半衰期的小分子神經(jīng)遞質(zhì)，化學(xué)名N-乙?；?5甲氧基色胺，是一種高度雙親性(親脂性和親水性)吲哚胺類(lèi)化合物，由于其代謝產(chǎn)物2-羥基褪黑素、N-乙?；逅?、5-甲氧基色胺等均具有較強(qiáng)抗氧化性，故認(rèn)為MT具有級(jí)聯(lián)抗氧化效應(yīng)。在動(dòng)物和人體中具有提高睡眠質(zhì)量、提高機(jī)體免疫力、抗氧化、抗凋亡、延緩衰老、抑制腫瘤細(xì)胞生長(zhǎng)等多種藥理功能[1-3]。隨著檢測(cè)技術(shù)的發(fā)展，1995年首次在植物的果實(shí)、莖和葉等器官均發(fā)現(xiàn)MT的存在，以植物種子中含量最高，在植物體中發(fā)揮著調(diào)節(jié)晝夜節(jié)律和光周期、調(diào)節(jié)植物生長(zhǎng)發(fā)育、抗生物和非生物逆境(重金屬、鹽害、病原菌等)等生理作用[4]。研究表明，光合細(xì)菌細(xì)胞中MT能夠保護(hù)光合作用色素，釀酒酵母發(fā)酵過(guò)程中產(chǎn)生的MT可以上調(diào)SOD、CAT、GPX的活性和硫氧還蛋白基因表達(dá)水平，增強(qiáng)酵母在過(guò)氧化氫、UV等脅迫時(shí)的抵御能力[5-7]。

研究表明，在培養(yǎng)基中添加一定濃度的水楊酸、乙烯、茉莉酸和一氧化氮等物質(zhì)均可激活靈芝酸生物合成途徑中關(guān)鍵酶基因的表達(dá)，誘導(dǎo)靈芝酸的生物合成[8-10]。既然植物MT與水楊酸、生長(zhǎng)素和一氧化氮等植物激素存在著一定的互作與對(duì)話(huà)，那么MT可能具有誘導(dǎo)靈芝菌絲體產(chǎn)生靈芝酸的作用[11]。本文在靈芝菌絲體發(fā)酵的對(duì)數(shù)生長(zhǎng)期添加MT作為誘導(dǎo)劑，研究了MT對(duì)抗癌劑靈芝酸誘導(dǎo)作用的濃度效應(yīng)和時(shí)間效應(yīng)，初步探索MT在真菌靈芝中的生物功能，以期提高靈芝酸產(chǎn)量，為大規(guī)模發(fā)酵生產(chǎn)靈芝酸提供理論指導(dǎo)。

1 材料與方法

1.1 材料

靈芝菌種(Ganodermalucidum)由上海農(nóng)科院食用菌研究所提供。

1.2 儀器與設(shè)備

756-MC型可見(jiàn)分光光度計(jì)(上海元析儀器有限公司)；YXQ-LS50S11立式壓力蒸汽滅菌器(上海云泰儀器儀表有限公司)；HZ-300 L恒溫?fù)u床(武漢瑞華儀器設(shè)備有限公司)；TGL-16G高速臺(tái)式離心機(jī)(北京時(shí)代北利離心機(jī)有限公司)；SW-CJ-2FD雙人單面凈化工作臺(tái)(鄭州南北儀器設(shè)備有限公司)；XHF-D高速分散器等(寧波新芝生物科技股份有限公司)。乙醇(分析純，合肥工業(yè)大學(xué)化學(xué)試劑廠(chǎng))；熊果酸、高氯酸、香草醛、冰乙酸、蛋白胨均為分析純(國(guó)藥試劑公司)。

1.3 菌種培養(yǎng)與處理

靈芝菌種在斜面培養(yǎng)基(馬鈴薯200 g/L、蛋白胨10 g/L、葡萄糖20 g/L、瓊脂 15 g/L)中保存；接種至種子液培養(yǎng)基(馬鈴薯200 g、KH2PO41 g/L、MgSO41 g/L、酵母浸出粉10 g/L、蛋白胨10 g/L、葡萄糖20 g/L)培養(yǎng)種子液；接種在液體培養(yǎng)基(KH2PO41 g/L、MgSO41 g/L、葡萄糖20 g/L、玉米粉4 g/L、蛋白胨10 g/L)進(jìn)行發(fā)酵，接種量5%；250 mL三角錐形瓶中裝液量100 mL；28 ℃，150 rpm，培養(yǎng)時(shí)間依試驗(yàn)需要確定。

1.4 生物量測(cè)定

發(fā)酵液在6 000 rpm 離心10 min，棄上清，將沉淀于-50 ℃真空冷凍干燥至恒重，稱(chēng)重。

1.5 標(biāo)準(zhǔn)曲線(xiàn)

準(zhǔn)確稱(chēng)取熊果酸標(biāo)準(zhǔn)品5.0 mg，溶于乙酸乙酯定容至50.0 mL容量瓶中，混勻得熊果酸標(biāo)準(zhǔn)溶液(100 mg/L)。分別取0.10、0.20、0.40、0.60、0.80、1.00 mL熊果酸標(biāo)準(zhǔn)溶液置于帶蓋試管，加熱揮去溶劑，加入現(xiàn)配制的0.40 mL 5%香草醛-冰乙酸和1.0 mL高氯酸，在65 ℃加熱15 min，冷卻至室溫，加入5.0 mL冰乙酸，搖勻靜置15 min，于547.5 nm測(cè)定吸光值，標(biāo)準(zhǔn)曲線(xiàn)為：y=0.008 8X+0.079 7(R2=0.998 2)。

1.6 靈芝酸提取與測(cè)定

稱(chēng)取干燥菌絲體0.1 g，加入10 mL乙醇，常溫超聲波3 h，6 000 rpm離心20 min，取上清液5 mL，重復(fù)浸提3次，合并上清液。根據(jù)標(biāo)準(zhǔn)曲線(xiàn)法測(cè)定靈芝酸含量，并計(jì)算其產(chǎn)量。

1.7 數(shù)據(jù)處理與統(tǒng)計(jì)分析

數(shù)據(jù)處理使用Excel 2007；統(tǒng)計(jì)分析使用SPSS 19.0軟件。

2 結(jié)果與分析

2.1 不同濃度褪黑素對(duì)深層發(fā)酵靈芝菌絲體生物量、靈芝酸含量和產(chǎn)量的影響

圖1 不同濃度褪黑素對(duì)靈芝菌絲生物量(A)、靈芝酸含量(B)和靈芝酸產(chǎn)量(C)的影響

種子液擴(kuò)大培養(yǎng)至第3天時(shí)添加除菌的不同濃度褪黑素溶液，繼續(xù)培養(yǎng)至第7天收獲菌絲體。由圖1A可知，褪黑素濃度為10、20、30、50、100 μmol/L試驗(yàn)組菌絲體生物量均高于對(duì)照組，其中50 μmol/L試驗(yàn)組菌絲體生物量為7.91 g/L。由于褪黑素濃度為20 μmol/L時(shí)，靈芝酸含量與靈芝酸產(chǎn)量均達(dá)到最大值，分別為32.29、244.53 mg/L(圖1B、1C)，故優(yōu)選該濃度進(jìn)行后續(xù)試驗(yàn)。

2.2 不同時(shí)間褪黑素對(duì)深層發(fā)酵靈芝菌絲體生物量、靈芝酸含量和產(chǎn)量的影響

在擴(kuò)大培養(yǎng)不同時(shí)間添加20 μmol/L褪黑素，繼續(xù)培養(yǎng)至第7天收獲菌絲體，探究褪黑素不同添加時(shí)間對(duì)靈芝深層發(fā)酵的影響。結(jié)果表明，第4 d加入褪黑素顯著提高靈芝菌絲體生物量(圖2A)，且提高靈芝酸含量與產(chǎn)量最明顯(P<0.05)，分別達(dá)到31.66、358.69 mg/L，為對(duì)照組的1.39、1.74倍。故下面試驗(yàn)選擇第4天加入褪黑素。

圖2 褪黑素不同添加時(shí)間對(duì)靈芝菌絲生物量(A)、靈芝酸含量(B)和靈芝酸產(chǎn)量(C)的影響

2.3 不同收獲時(shí)間褪黑素對(duì)深層發(fā)酵靈芝菌絲體生物量、靈芝酸含量和產(chǎn)量的影響

在菌絲體擴(kuò)大培養(yǎng)至第4天時(shí)加入20 μmol/L褪黑素，繼續(xù)培養(yǎng)至第5、7、8、9、11天收獲菌絲體。結(jié)果表明，第11天收獲菌絲體生物量最高(圖3A)，第8天收獲時(shí)靈芝酸含量(圖3B)與產(chǎn)量(圖3C)均達(dá)到最大值。

綜上所述，本試驗(yàn)獲得最佳方案為：擴(kuò)大培養(yǎng)至培養(yǎng)第4天加入20 μmol/L褪黑素，繼續(xù)培養(yǎng)第8天收獲菌絲體，靈芝酸產(chǎn)量達(dá)到最大值393.88 mg/L。

圖3 不同收獲時(shí)間對(duì)靈芝菌絲生物量(A)、靈芝酸含量(B)和靈芝酸產(chǎn)量(C)的影響

3 結(jié)論與討論

目前，有關(guān)褪黑素在在動(dòng)物和植物細(xì)胞內(nèi)抵御不良環(huán)境引起的氧化脅迫方面的研究報(bào)道較多，其主要作用方式如下：(1)作為強(qiáng)抗氧化劑，褪黑素可以直接清除羥基自由基等活性氧，(2)刺激SOD、CAT和GPX等抗氧化酶活性升高而增強(qiáng)細(xì)胞抗氧化能力;(3)提升細(xì)胞內(nèi)還原型谷胱甘肽和抗壞血酸等含量;(4)提高線(xiàn)粒體內(nèi)膜上電子傳遞體的效率而減少活性氧的生成[12-13]。有關(guān)褪黑素在微生物中的相關(guān)研究非常少，僅有幾篇文獻(xiàn)報(bào)道釀酒酵母在發(fā)酵過(guò)程中細(xì)胞內(nèi)褪黑素水平與其生長(zhǎng)曲線(xiàn)呈現(xiàn)正相關(guān)，可能具有促進(jìn)生長(zhǎng)代謝作用[14-15]，外源褪黑素處理可以上調(diào)釀酒酵母細(xì)胞中SOD、CAT、GPX酶活性和硫氧還蛋白基因表達(dá)水平，增強(qiáng)酵母在過(guò)氧化氫、UV等脅迫時(shí)的抵御能力[5-7]，其具體的生理功能未見(jiàn)報(bào)道。不過(guò)，經(jīng)酵母發(fā)酵的食品(如面包、啤酒、紅酒和果酒等)中褪黑素及其同分異構(gòu)體含量顯著升高，表明褪黑素及其同分異構(gòu)體與微生物有著密不可分的關(guān)系[16]。

在動(dòng)物和植物細(xì)胞中，褪黑素作為誘導(dǎo)劑誘導(dǎo)次生代謝產(chǎn)物方面的研究報(bào)道較少。最近，許麗麗等的研究表明，100 μmol/L褪黑素浸泡轉(zhuǎn)色期的葡萄果實(shí)，能夠誘導(dǎo)上調(diào)30個(gè)葡萄芪類(lèi)合酶基因sts表達(dá)，顯著提高葡萄果實(shí)中白藜蘆醇含量[17]。Gong等的研究發(fā)現(xiàn)，5 μmol/L褪黑素澆灌處理Malus hupehensis，可以上調(diào)多胺生物合成相關(guān)的6個(gè)關(guān)鍵酶基因轉(zhuǎn)錄水平，提高細(xì)胞中多胺含量，從而增強(qiáng)抗堿脅迫能力[18]。李大菲等報(bào)道，1 μmol/L褪黑素和光照聯(lián)合脅迫單針藻細(xì)胞，乙酰輔酶A羧化酶和蘋(píng)果酸酶活性上升而磷酸烯醇式丙酮酸羧化酶活性下調(diào)，有效促進(jìn)了微藻細(xì)胞油脂的積累[19]。

本研究表明，10～100 μmol/L褪黑素溶液處理均能提高靈芝菌絲體生物量(圖1A)，說(shuō)明褪黑素具有促進(jìn)靈芝菌絲生長(zhǎng)的作用，這與Bisquert等以酵母為材料的研究結(jié)果相一致。一般認(rèn)為褪黑素可以縮短真菌生長(zhǎng)滯后期，使其提前進(jìn)入對(duì)數(shù)生長(zhǎng)期[6]。液體發(fā)酵培養(yǎng)至第4天加入褪黑素，繼續(xù)培養(yǎng)至第8天收獲能夠顯著提高靈芝酸含量和靈芝酸產(chǎn)量，這符合靈芝生長(zhǎng)規(guī)律和次生代謝產(chǎn)物產(chǎn)生規(guī)律[7]。這是有關(guān)褪黑素在大型真菌靈芝菌絲上應(yīng)用的首次報(bào)道，其具體的誘導(dǎo)機(jī)制可能與水楊酸和生長(zhǎng)素等類(lèi)似。近來(lái)的研究發(fā)現(xiàn)，水楊酸、乙烯、茉莉酸和生長(zhǎng)素等植物激素均可誘導(dǎo)靈芝酸生物合成相關(guān)酶的基因表達(dá)，從而提高靈芝酸含量[9-10]；由于褪黑素的化學(xué)結(jié)構(gòu)與生長(zhǎng)素類(lèi)似，其在植物中的生理功能與生長(zhǎng)素和水楊酸等有相同之處，褪黑素可能是通過(guò)與水楊酸或者生長(zhǎng)素等信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)途徑誘導(dǎo)靈芝酸的生物合成[4]。

此外，靈芝酸的合作需要氧化脅迫環(huán)境，一定濃度的水楊酸、一氧化氮、過(guò)氧化氫和醋酸等物質(zhì)可誘導(dǎo)活性氧水平的提高，誘導(dǎo)靈芝酸MVA生物合成途徑中相關(guān)酶基因的表達(dá)，從而促進(jìn)靈芝酸生物合成[9]。在動(dòng)物細(xì)胞內(nèi)的褪黑素發(fā)揮抗癌作用時(shí)，是通過(guò)刺激脂氧合酶活性而促發(fā)活性氧產(chǎn)生[1]。Gong等研究顯示，褪黑素通過(guò)降低番茄細(xì)胞中的一氧化氮解除NADPH氧化酶的硝?；癄顟B(tài)而使酶活性升高，從而促使信號(hào)分子H2O2水平升高，刺激抗性基因表達(dá)水平上調(diào)，最終促發(fā)堿氧化脅迫耐性[20]。靈芝細(xì)胞中的褪黑素是通過(guò)刺激脂氧合酶活性還是解除NADPH氧化酶硝?；龠M(jìn)H2O2等活性氧產(chǎn)生，從而導(dǎo)致靈芝酸生物合成能力增強(qiáng)，有待進(jìn)一步研究。