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(安徽科技學(xué)院,安徽 鳳陽 233100)

老鴉瓣(Tulipaedulis)為百合科郁金香屬藥用植物[1]，別名迎春草、光慈姑，是早春開放的一種野花，屬多年生草本植物。老鴉瓣除去絨毛后的干燥鱗莖為光慈姑[2]。光慈姑味甘、性寒；具有抑菌、解毒散結(jié)、行血化癡之功效；主治咽喉腫痛、痛病、痛癥、瘡腫、產(chǎn)后癡滯[3]。老鴉瓣富含淀粉、生物堿[4]、黃酮類[5]等物質(zhì)。生物類黃酮是在植物中分布廣泛的一類天然產(chǎn)物，廣泛存在于植物界，是許多中草藥的有效成分[6]。一些生物類黃酮具有良好的抗氧化活性[7]，目前老鴉瓣的研究主要集中在本草考證[8]、生理生物學(xué)特性[9]以及栽培繁育[10]等方面，但對(duì)老鴉瓣黃酮[11-12]抗氧化性的研究鮮有報(bào)道。目前,安徽蒙城地區(qū)有農(nóng)戶大量種植，在該地區(qū)老鴉瓣不僅作為一種中藥，同時(shí)還作為一種保健品和食材。

本試驗(yàn)以乙醇為提取溶劑，采用恒溫水浴浸提法提取老鴉瓣黃酮，并通過正交試驗(yàn)優(yōu)化提取工藝，同時(shí)對(duì)老鴉瓣黃酮的體外抗氧化活性進(jìn)行探討，以期為老鴉瓣黃酮類化合物的開發(fā)利用提供理論依據(jù)。

1 材料與方法

1.1 材料與試劑

老鴉瓣由安徽迎春草生物科技有限公司提供。NaNO2(AR，上海弘順生物科技有限公司)；Vc(AR，上海試四赫維化工有限公司)；Tris(AR，上海化學(xué)試劑有限公司)；Al(NO3)3、FeSO4(AR，國藥集團(tuán)化學(xué)試劑有限公司)；DPPH(1,1-二苯基-2-三硝基苯肼)(AR，美國Sigma公司)；鄰苯三酚(AR，上海振企化學(xué)試劑有限公司)；槲皮素標(biāo)準(zhǔn)品(國藥集團(tuán)化學(xué)試劑有限公司，批號(hào)Lot.No.F20051117)。

1.2 試驗(yàn)儀器與設(shè)備

AR2140電子天平(梅特勒-托利多(上海)有限公司)；Y-800G型中草藥粉碎機(jī)(天津市泰斯特儀器有限公司)；DT5-4型低速大容量多管離心機(jī)(北京時(shí)代北利離心機(jī)有限公司)；U-T6PC紫外可見分光光度計(jì)(屹譜儀器制造(上海)有限公司)。

1.3 方法

1.3.1 老鴉瓣提取工藝流程及其主要影響因素

(1)老鴉瓣提取工藝流程：老鴉瓣樣品→去雜→烘干→粉碎過篩→加入乙醇→溫水浴浸提→離心→濃縮→冷凍干燥→收集黃酮→計(jì)算提取率。

提取率(%) =[(X×D×V)/1 000W]×100%

其中：X為待測液的濃度，單位：mg/mL；D為稀釋倍數(shù)；V為提取液的體積，單位：mL；W為老鴉瓣質(zhì)量，單位：g。

(2)單因素試驗(yàn)：分別研究了料液比(1∶10、1∶15、1∶20、1∶25、1∶30)、提取時(shí)間(40、60、80、100、120 min)、乙醇體積分?jǐn)?shù)(45%、55%、65%、75%、85%)對(duì)黃酮提取率的影響。

(3)正交試驗(yàn)設(shè)計(jì)：根據(jù)單因素試驗(yàn)結(jié)果，以黃酮的提取率為綜合考察指標(biāo)，選定乙醇體積分?jǐn)?shù)(A)、料液比(B)、提取時(shí)間(C)三因素三水平，進(jìn)行正交試驗(yàn)設(shè)計(jì)[13]。

在單因素試驗(yàn)基礎(chǔ)上，設(shè)計(jì)正交試驗(yàn)，探究3個(gè)因素對(duì)黃酮提取率的綜合影響[14]。正交試驗(yàn)水平與因素見表1。

表1 正交試驗(yàn)因素水平表

1.3.2 黃酮鑒定及其含量的測定 準(zhǔn)確稱取槲皮素標(biāo)準(zhǔn)品10 mg，60%的乙醇溶解定容至100 mL容量瓶中，得到0.1 mg/mL槲皮素標(biāo)準(zhǔn)溶液[11]。用硝酸鋁法測定黃酮[12]。以槲皮素的含量為橫坐標(biāo)X，繪制標(biāo)準(zhǔn)曲線，方程為Y=1.072 9X+0.002 1，Y表示吸光度，R2=0.999 8。

1.3.3 老鴉瓣黃酮體外抗氧化試驗(yàn) 采用鐵氰化鉀還原法[15]、DPPH法[16]、鄰二氮菲法[17]、鄰苯三酚自氧化法[18]分別對(duì)老鴉瓣黃酮的DPPH自由基清除能力、羥基自由基清除能力、超氧陰離子自由基清除能力的測定，測定3次，取其平均值。

2 結(jié)果與分析

2.1 老鴉瓣黃酮提取的單因素試驗(yàn)

2.1.1 料液比對(duì)老鴉瓣黃酮提取率的影響 由圖1可知，隨著料液比的增加，老鴉瓣黃酮的提取率先升高后趨于平緩，說明此時(shí)老鴉瓣黃酮已經(jīng)充分溶解，黃酮提取率不再發(fā)生變化，這與皇甫陽鑫提取銀杏葉黃酮考察料液比的結(jié)果一致[18]。

圖1 不同料液比對(duì)黃酮提取率的影響

2.1.2 提取時(shí)間對(duì)老鴉瓣黃酮提取率的影響 由圖2可知，隨著提取時(shí)間的增加，老鴉瓣黃酮的提取率先升高后下降，提取時(shí)間不足，老鴉瓣黃酮未能完全溶出，提取時(shí)間過長，引起老鴉瓣黃酮分解或損失，從而導(dǎo)致提取率降低。

圖2 不同提取時(shí)間對(duì)黃酮提取率的影響

2.1.3 乙醇體積分?jǐn)?shù)對(duì)老鴉瓣黃酮提取率的影響 由圖3可知，隨著乙醇體積分?jǐn)?shù)的增大，老鴉瓣黃酮的提取率先升高后下降，因?yàn)椴煌w積分?jǐn)?shù)的乙醇改變了相應(yīng)的水溶液極性，老鴉瓣黃酮在乙醇體積分?jǐn)?shù)為65%時(shí)溶出性較好。

圖3 乙醇體積分?jǐn)?shù)對(duì)黃酮提取率的影響

2.2 正交試驗(yàn)結(jié)果

2.2.1 正交試驗(yàn)結(jié)果 采用L9(34)正交表進(jìn)行試驗(yàn)，試驗(yàn)每組平行測定3次，各取平均值，通過之前的線性回歸方程計(jì)算結(jié)果并進(jìn)行分析。計(jì)算與分析結(jié)果見表2～3。

表2 正交試驗(yàn)結(jié)果

表3 正交試驗(yàn)方差分析結(jié)果

由表2～3可知，極值R的大小顯示3種因素對(duì)老鴉瓣黃酮的提取率存在著不同的影響，其相應(yīng)的影響大小順序依次是A>C>B，在5%的相對(duì)水平上，乙醇的體積分?jǐn)?shù)和提取時(shí)間對(duì)老鴉瓣黃酮提取率的影響相對(duì)于料液比較為顯著，有數(shù)據(jù)結(jié)果可知，選擇A2、B1、C2這個(gè)組合作為老鴉瓣黃酮提取的最佳組合，提取率為3.46 %。

2.2.2 驗(yàn)證試驗(yàn) 根據(jù)正交試驗(yàn)得到的結(jié)果，老鴉瓣黃酮提取的最佳組合是A2、B1、C2，按照此條件對(duì)該結(jié)果進(jìn)行驗(yàn)證試驗(yàn)，此條件時(shí)的黃酮提取率平均為3.47%(表4)。

表4 驗(yàn)證性實(shí)驗(yàn)結(jié)果

2.3 老鴉瓣黃酮體外抗氧化能力

2.3.1 老鴉瓣黃酮對(duì)DPPH自由基清除能力 由圖4可知，老鴉瓣黃酮對(duì)DPPH自由基有一定的清除能力，在不同濃度時(shí)對(duì)DPPH自由基清除能力呈現(xiàn)一定的線性關(guān)系，在濃度5 mg/mL時(shí)清除率可達(dá)63.57%。

圖4 DPPH自由基清除能力測定

2.3.2 老鴉瓣黃酮對(duì)羥基自由基清除能力 由圖5可知，老鴉瓣黃酮對(duì)羥基自由基有一定的清除能力。老鴉瓣黃酮在不同濃度時(shí)對(duì)羥基自由基清除能力呈現(xiàn)一定的線性關(guān)系，在濃度5 mg/mL時(shí)清除率可達(dá)53.97%。

圖5 羥基自由基清除能力測定

2.3.3 老鴉瓣黃酮對(duì)超氧陰離子自由基清除能力 由圖6可知，老鴉瓣黃酮對(duì)超氧陰離子自由基有一定的清除能力。老鴉瓣黃酮在不同濃度時(shí)對(duì)超氧陰離子自由基清除能力呈現(xiàn)一定的線性關(guān)系，在濃度5 mg/mL時(shí)清除率可達(dá)44.53%。

圖6 超氧陰離子自由基清除能力測定

3 結(jié)論與討論

老鴉瓣作為營養(yǎng)保健型中草藥正日益受到消費(fèi)者關(guān)注，其研究與開發(fā)也在逐步深入。本試驗(yàn)通過正交試驗(yàn)優(yōu)化試驗(yàn)設(shè)計(jì)結(jié)果得出老鴉瓣黃酮的最佳提取條件為：料液比1∶20(g/mL)、乙醇體積分?jǐn)?shù)65%、提取時(shí)間為80 min、提取溫度65 ℃，老鴉瓣黃酮提取率可達(dá)3.46 %。從試驗(yàn)結(jié)果可知，老鴉瓣黃酮具有一定的抗氧化能力，且隨著黃酮濃度增大而增加，對(duì)DPPH自由基、羥基自由基和超氧陰離子自由基的最高清除率分別達(dá)到63.57%、53.97%、44.53%，為老鴉瓣的進(jìn)一步開發(fā)利用提供實(shí)驗(yàn)和參考依據(jù)。

在方差分析中可以看出料液比對(duì)老鴉瓣黃酮提取率的影響并無顯著性，提取時(shí)間對(duì)其影響較為顯著，而乙醇體積分?jǐn)?shù)對(duì)其影響最為顯著。乙醇是極性溶劑，黃酮化合物具有酚羥基，是一種常見的極性基團(tuán)，根據(jù)相似相溶原理，老鴉瓣黃酮在乙醇體積分?jǐn)?shù)為65%溶出性最好，乙醇體積分?jǐn)?shù)過高或過低，都會(huì)影響老鴉瓣黃酮的提取率。