宋程飛，郝敬云，程蔚蘭，史飛飛，季春麗，李潤植

(山西農業(yè)大學 分子農業(yè)與生物能源研究所，山西 太谷 030801)

杜氏鹽藻(Dunaliellasalina)是一種光自養(yǎng)的單細胞真核綠藻，細胞沒有纖維質細胞壁，在高鹽(NaCl濃度>30%)環(huán)境下能夠正常生長。一些鹽藻株系能高水平合成β-胡蘿卜素(>10%細胞干重)和油脂(40%～50%細胞干重)，是生產天然β-胡蘿卜素和優(yōu)質生物燃料的良好原料[1,2]。杜氏鹽藻細胞結構簡單、易于建立規(guī)模培養(yǎng)體系對鹽堿地進行改良和利用。特別是鹽藻能在高鹽環(huán)境下正常生長，大規(guī)模養(yǎng)殖不易發(fā)生病蟲等污染，這使得鹽藻成為一種進行目標化合物生物合成途徑基因修飾的理想生物種質材料，進而以遺傳改造的鹽藻工程株系為平臺商業(yè)化生產高附加值天然產品[3,4]。

目前, 已有采用基因槍法[5,6]、玻璃珠法[7,8]、超聲波法[9]轉化鹽藻獲得成功的報道，這些轉化方法存在操作繁雜和成本高、轉化效率低且不穩(wěn)定等缺陷。Brown等[10]使用電擊法對微藻進行遺傳轉化，不僅成本低而且操作起來簡單快捷，易于建立標準的轉化程序。耿德貴等[11～13]和孫煜等[14]也報道了使用電擊法成功轉化杜氏鹽藻的相關內容。迄今為止，有關鹽藻遺傳轉化試驗多是將GUS、GFP等報告基因導入細胞中。馮書營等[8]使用玻璃珠轉化法，成功地將GUS報告基因轉化進入鹽藻細胞中。耿德貴等[12]使用電擊法轉化鹽藻細胞，瞬時表達了GUS和GFP報告基因。然而，鮮有報道應用目標功能基因對杜氏鹽藻遺傳轉化，已有的鹽藻轉化方法難以重復獲得穩(wěn)定轉化株系。

為此，本研究在系統(tǒng)分析杜氏鹽藻生長和發(fā)育特性的基礎上，以植物表達載體pCAMBIA3301為骨架，構建高效表達來自富油植物斑鳩菊(Vernoniagalamensis)VgDGAT1a基因(編碼控制TAG合成的關鍵酶DGAT)的載體，以抗除草劑草銨膦Bar基因為選擇標記，對鹽藻進行電轉化并優(yōu)化了各項技術參數，以期獲得高效簡便的鹽藻遺傳轉化體系，為進一步對鹽藻進行代謝組裝，培育富集目標化合物的優(yōu)異鹽藻工程株系和實現高值微藻產品商業(yè)化生產提供理論及技術支撐。

1 材料與方法

1.1 材料

試驗所用藻種為杜氏鹽藻 (Dunaliellasalina)，是由本實驗室在運城鹽湖所取水樣中分離純化所得，命名為YC-011。所用培養(yǎng)基為DM培養(yǎng)基(表1)。用于遺傳轉化的表達載體VgDGAT1a-pCAMBIA3301(圖1)載有除草劑草銨膦抗性基因Bar和外源目的基因VgDGAT1a，它編碼控制TAG合成的一個關鍵酶即DGAT1。

表1 DM培養(yǎng)基(母液)配方

注：其中A5 (Trace mental solution)的組成成分如下：H3BO32.86 g·L-1, MnCl2·4H2O 1.86 g·L-1,ZnSO4·7H2O 0.22 g·L-1, Na2MoO4·2H2O 0.39 g·L-1, CuSO4·5 H2O 0.08 g·L-1, Co(NO3)2·6 H2O 0.05 g·L-1。

Note: The composition of A5(Trace mental solution) is as follows: H3BO32.86 g·L-1, MnCl2·4H2O 1.86 g·L-1,ZnSO4·7H2O 0.22 g·L-1, Na2MoO4·2H2O 0.39 g·L-1, CuSO4·5 H2O 0.08 g·L-1, Co(NO3)2·6 H2O 0.05 g·L-1.

圖1 用于鹽藻轉化的超表達VgDGAT1a基因載體圖譜簡示Fig.1 Schematic diagram showing VgDGAT1a overexpression vector used for Dunaliella salina transformation

1.2 方法

1.2.1 杜氏鹽藻生長曲線的繪制

取生長至對數期的鹽藻培養(yǎng)液，按體積比1∶10的接種量進行接種，在溫度(24士0.5) ℃、光強3 000 Lux，光暗比16 h∶8 h的條件下培養(yǎng)。每天上午9時，對培養(yǎng)液的吸光度值進行測定，3次重復，取平均值作為當天的測試結果。然后繪制生長曲線，橫坐標為培養(yǎng)時間，縱坐標為吸光度值。

1.2.2 鹽藻對除草劑草銨膦的敏感性試驗

(1)液體培養(yǎng)篩選

取培養(yǎng)至第7天的鹽藻細胞，取適量草銨膦加入培養(yǎng)基中，終濃度梯度設置為0、10、20、30、40、50 mg·L-1等，每個梯度6次重復，培養(yǎng)條件同1.2.1。

每天上午9點和下午4點對藻細胞的形態(tài)各進行一次觀察和記錄。培養(yǎng)至對數期時，通過稀釋平板計數法進行細胞計數，分別計算各篩選濃度下藻細胞的致死率。

(2)固體培養(yǎng)篩選

配置含草銨膦(PPT)的固體篩選培養(yǎng)基，草銨膦濃度梯度分別為0、5、10、15、20 mg·L-1。取100 μL對數期的鹽藻細胞，均勻涂布于DM固體篩選培養(yǎng)基上。每個梯度設置6組重復。培養(yǎng)條件同1.2.1，培養(yǎng)24 h后，將平板倒置。隨后每天上午9點和下午4點，各進行一次觀察，并記錄藻落數量和生長變化。

1.2.3 鹽藻電擊轉化體系的建立及優(yōu)化

(1)試驗材料

取培養(yǎng)至第7天的藻細胞，4 500 r·min-1離心5 min，棄上清。用新鮮培養(yǎng)基對收集的細胞沖洗一次，再次離心，收集鹽藻細胞于離心管底部。加2×HEPES[11]電擊緩沖液(HEPES 0.04 mol·L-1、NaCl 1 mol·L-1、KCl 0.01 mol·L-1、CaCl20.01 mol·L-1、甘露醇0.4 mol·L-1、山梨醇0.4 mol·L-1)調整藻液濃度至1×106個·mL-1。取400 μL藻液轉移至1.5 mL EP管中，冰浴5～10 min后用于下一步電轉化。依次確定最佳脈沖時間、脈沖電壓、質粒濃度和藻細胞培養(yǎng)時間內。

(2)電擊轉化鹽藻細胞

將冰浴的質粒和藻細胞混合液移至經預冷處理的0.2 cm電擊杯中，參照李海東等[15]的方法，依據設置好的脈沖電壓、脈沖時間、質粒濃度和藻細胞培養(yǎng)天數等梯度參數，進行電擊轉化，每個參數分別重復6次。

(3)轉化細胞的培養(yǎng)

將轉化的鹽藻細胞立即冰浴5 min后，從電擊杯移至1.5 mL EP管中。6 000 r·min-1離心3 min，倒掉上清液。向離心管底部細胞沉淀加1 mL 培養(yǎng)基，用移液槍反復吹打均勻。避光靜置過夜培養(yǎng)，使藻細胞恢復生長。在顯微鏡下，統(tǒng)計完整細胞數和總細胞數(完整細胞數+破碎細胞數)。兩者數目之比值即為細胞存活率。

(4)篩選陽性轉化藻細胞

常溫下，收集經過電擊轉化的鹽藻細胞。6 000 r·min-1離心5 min后，棄上清。加入60 μL培養(yǎng)基，重懸沉淀于離心管底部的藻細胞。取重懸浮的藻細胞涂布于DM固體篩選(含20 mg·L-1草銨膦)培養(yǎng)基，并設對照。培養(yǎng)至不再有新藻落長出且藻落數基本穩(wěn)定，在第18天時，進行單藻落計數。篩選和非篩選培養(yǎng)基上的藻落數目比值即為電擊轉化鹽藻的轉化效率/%。

(5)鹽藻細胞電擊轉化體系的優(yōu)化

轉化過程中，設置不同的脈沖電壓、脈沖時間、藻細胞培養(yǎng)時間、質粒濃度，對轉化后細胞存活率和轉化效率進行比較。

1.2.4 草銨膦抗性轉化藻株的分子鑒定

取1×109個杜氏鹽藻轉化子細胞，用CTAB法提取基因組DNA[15]。用Trizol法提取總RNA[15]，反轉錄獲得cDNA。分別以DNA和cDNA為模板，進行PCR擴增，分子鑒定轉基因的整合和表達。

用于擴增目的基因的引物序列為：

F(forward): GCTCTAGAGCCATGGCGT

TATTAGATACG

R (reverse): TCCCCCGGGGGATTATTTGC TTTTCCCCTTTT

VgDGAT1a基因的PCR反應程序：

擴增完成后，進行1%的瓊脂糖凝膠電泳，檢測PCR結果。

2 結果與分析

2.1 繪制鹽藻生長曲線

每天在同一時間點取杜氏鹽藻培養(yǎng)液，在最佳波長下進行吸光度的測定，設置3組平行重復。在繪制生長曲線時，以培養(yǎng)時間作為橫坐標、OD684值作為縱坐標，如圖2所示?？梢姡}藻細胞生長呈“S”型，生長至第7天時，鹽藻細胞進入對數生長期。

圖2 杜氏鹽藻的生長曲線Fig.2 The growth curve of Dunaliella salina

2.2 篩選陽性轉化子的最適草銨膦濃度

2.2.1 液體培養(yǎng)篩選所用草銨膦濃度的確定

液體篩選培養(yǎng)基培養(yǎng)藻細胞至對數期時，各篩選濃度下藻細胞的致死率如表2?？梢?，隨著草銨膦濃度的增加，細胞死亡率增大；至40 mg·L-1時細胞致死率為100%。

表2不同劑量草銨膦液體培養(yǎng)中鹽藻在第7天的死亡率

Table 2 The lethal rate ofDunaliellasalinaon day 7 in the liquid medium with different dose of glufosinate-ammonium

濃度/mg·L-1Concentration死亡率/%Lethalrate00e1016.2±0.022d2037.9±0.035c3072.6±0.045b40100a50100a

注: 表中小寫字母表示處理間存在顯著性差異(P<0.05)。

Note: small letters indicate that the differences between treatments are significant atP<0.05.

由圖3可見，低濃度草銨膦(10 mg·L-1)就造成部分藻細胞解體，細胞內容物流出，藻細胞完全致死的草銨膦濃度為40 mg·L-1。因此，液體培養(yǎng)基中的篩選濃度選擇40 mg·L-1。

2.2.2 固體培養(yǎng)篩選所用草銨膦濃度的確定

固體篩選培養(yǎng)基培養(yǎng)藻細胞，各篩選濃度下藻細胞長出的時間及其生長狀態(tài)和數量如表3。

由表3可見，生長至第4天時，對照組有嫩綠色藻落長出，長勢良好，在培養(yǎng)基表面成片生長。草銨膦濃度為5 mg·L-1的培養(yǎng)基，與對照組相比，藻落長出的時間推遲5 d，藻落顏色嫩綠，生長密集。10 mg·L-1草銨膦的培養(yǎng)基，第13天時藻落才長出，顏色淺，數量少，均為單藻落，說明10 mg·L-1草銨膦對藻細胞有一定的抑制作用。15 mg·L-1草銨膦篩選培養(yǎng)基，到30 d時，僅有幾個單藻落，說明此濃度草銨膦顯著抑制了鹽藻細胞的生長。20 mg·L-1草銨膦篩選培養(yǎng)基，沒有藻落長出(圖4)，藻細胞生長完全被抑制。因此，實驗確定以20 mg·L-1草銨膦濃度作為在固體培養(yǎng)基中篩選轉基因鹽藻的濃度。

圖3 不同濃度草銨膦對鹽藻存活的影響Fig.3 Effects of different concentration of glufosinate-ammonium on Dunaliella salina survival

Table3 The tolerance ofDunaliellasalinato glufosinate-ammonium in solid medium

濃度/mg·L-1Concentration藻落長出所需時間/dTimeneededforalgaespotformation生長狀態(tài)與藻落數量Growthstatusandcellnumber04細胞鮮綠色,藻落密集成片59細胞顏色嫩綠,藻落密集成片1013細胞顏色變淺綠,藻落數較對照組減少,均是單藻落1530藻落顏色發(fā)黃,藻落數極少20--

圖4 不同濃度草銨膦對鹽藻生長的影響Fig.4 Effects of different doses of glufosinate-ammonium on Dunaliella salina growth

由圖3和圖4可知，液體培養(yǎng)基中轉基因鹽藻的篩選濃度為40 mg·L-1；而固體培養(yǎng)基中的篩選濃度為20 mg·L-1。造成這種差異的原因可能是：一般情況下，與液體培養(yǎng)條件下的藻細胞相比，固體培養(yǎng)條件下的藻細胞生長速度慢，生長勢弱。因此，固體培養(yǎng)所用篩選基的篩選濃度比液體的篩選濃度低。而且，液體篩選時，藻液與培養(yǎng)基的接觸面積相對于固體篩選更大，所以致死濃度相對更高一些。

2.3 電擊法各轉化參數的優(yōu)化

2.3.1 電擊參數對細胞存活率的影響

脈沖電壓和脈沖時間對細胞存活率的影響如圖5，即脈沖電壓一定時，細胞存活率隨著脈沖時間的增長而下降；脈沖時間一定時，細胞存活率同樣隨著脈沖電壓增大而減小。

圖5 脈沖電壓和脈沖時間對杜氏鹽藻細胞存活率的影響Fig.5 The effect of pulse voltage and time on cell survival rate of Dunaliella salina

2.3.2 電擊參數對細胞轉化效率的影響

篩選和非篩選培養(yǎng)基上的藻落數目比值為鹽藻的轉化效率(‰)。由圖6得，脈沖電壓和脈沖時間分別為0.4 kV和4 ms時，篩選和非篩選培養(yǎng)基上的藻落數目比值最高，即轉化效率最高。

圖6 脈沖電壓和脈沖時間對杜氏鹽藻細胞轉化效率的影響Fig.6 The effect of pulse voltage and time on cell conversion efficiency of Dunaliella salina

2.3.3 藻細胞培養(yǎng)時間對轉化效率的影響

取培養(yǎng)天數不同、生長良好的鹽藻細胞即不同藻齡的細胞進行電擊轉化。由表4可見，在電擊參數相同的情況下，隨著藻細胞培養(yǎng)時間的增加轉化效率先升后降。其中，培養(yǎng)7 d的鹽藻細胞轉化效率最高，為1.98±0.01‰。培養(yǎng)7 d的藻細胞，正處于對數生長期，分裂旺盛，容易吸附外源基因，導致轉化效率高[16]。

表4藻細胞培養(yǎng)時間對轉化效率的影響

Table 4 Effects of different cell culture time on transformation efficiency ofDunaliellasalina

藻細胞培養(yǎng)時間/dculturetime脈沖電壓/kVpulsevoltage脈沖時間/mspulsetime轉化效率/‰transformationefficiency10.440e30.440.02±0.01d50.440.83±0.02c70.441.98±0.01a90.441.04±0.03b

注:表中小寫字母表示處理間存在顯著性差異(P<0.05)。

Note: small letters indicate that the differences between treatments are significant atP<0.05.

2.3.4 質粒濃度對鹽藻細胞轉化效率的影響

圖7顯示，在最佳脈沖電壓和脈沖時間下，鹽藻電擊轉化效率表現為隨著質粒濃度的增加先增后降，當質粒濃度6 mg·L-1時，轉化效率最高，約為2.63‰。

經上述各項檢測，確立了杜氏鹽藻電轉化技術的優(yōu)化體系。脈沖電壓和脈沖時間分別為：0.4 kV、4 ms；質粒濃度6 mg·L-1，培養(yǎng)7 d的鹽藻細胞為受體。鹽藻轉化效率高達2.63‰。

2.4 草銨膦抗性轉化株的分子鑒定

從固體篩選平板上隨機挑取4株單藻落，將其在液體篩選培養(yǎng)基中擴大培養(yǎng)，分別提取基因組DNA、總RNA，將RNA反轉錄成cDNA[16]。根據VgDGAT1a基因的上下游引物，進行PCR擴增。電泳結果(圖8、9)顯示，分別以轉基因鹽藻的DNA和cDNA為模板，PCR擴增片段與陽性對照大小一致(1 584 bp)。將PCR擴增片段送到生物公司測序。測序結果顯示PCR產物序列與VgDGAT1a基因序列(登陸號：EF653276)完全一致，說明鹽藻VgDGAT1a基因遺傳轉化成功，并且表達正確。

圖8 轉基因鹽藻VgDGAT1a DNA分子鑒定Fig.8 DNA identification of VgDGAT1a in transgenic Dunaliella salina 注：M：DNA Marker為DL2000，泳道1～4為4株轉基因鹽藻的DNA PCR擴增產物，泳道5為陽性對照Note: M: DNA lader 2000; lane 1～4: PCR product of transgenic Dunaliella salina; lane 5: positive control

圖9 轉基因鹽藻VgDGAT1a mRNA分子鑒定Fig.9 mRNA identification of VgDGAT1a in transgenic Dunaliella salina 注：M: Marker為DL2000；泳道1～4為轉基因藻株的反轉錄PCR擴增產物，泳道5為陰性對照Note: M: DNAlader 2000; lane 1～4: PCR product of transgenic Dunaliella salina, lane 5: negative control

3 討論與結論

近幾年來，藻類基因工程研究以及應用微藻規(guī)?；a高值天然化合物研發(fā)日益廣為關注。一些特色經濟藻類具有規(guī)?；囵B(yǎng)簡便、生長周期短、光合效率高和遺傳背景較高等植物簡單等特點，是進行基因修飾良好的生物種質，可通過代謝組裝培育能高效合成積累高值化合物的生物反應器[17,18]?；谇叭擞嘘P鹽藻遺傳轉化的研究[19,20]，本文對杜氏鹽藻電轉化技術進行優(yōu)化，建立了高效的電擊遺傳轉化體系。與其他轉化研究應用抗生素篩選轉化藻細胞不同，本文應用抗除草劑草銨膦基因為選擇標記，在培養(yǎng)基中加入20 mg·L-1草銨膦，就可殺死非轉化的藻細胞，獲得陽性轉化藻細胞速度快、效率高。

除使用表達載體和篩選標記外，其他影響鹽藻轉化效率因素包括受體藻細胞生長狀態(tài)及預處理、載有目的基因的質粒濃度、脈沖電壓、脈沖時間、緩沖液成分及用量，以及電擊后藻細胞處理等[20,21]。本研究對這些參數進行了系統(tǒng)優(yōu)化，轉化效率顯著提高(圖5)。Shimogawara等[19,22]以萊茵衣藻為轉基因受體，對電轉化參數進行優(yōu)化，轉化效率提高到2×105個轉化子/μg DNA。以鈍頂螺旋藻為受體藻種，王高歌等[23]利用電擊法進行轉化，亦獲得較高轉化效率(電擊導致細胞成活率為40%～60%)。本文通過調節(jié)電擊參數(脈沖電壓0.4 kV、脈沖時間4 ms)控制受體細胞存活率處于50%～70%區(qū)間，獲得較高的轉化率。本文建立的優(yōu)化鹽藻電擊轉化技術，以培養(yǎng)7 d處于對數生長期的鹽藻為受體，應用6 mg·L-1載體質粒濃度，在0.4 kV電壓、脈沖時間為4 ms條件下進行電轉化，獲得2.63‰的轉化效率，比現有方法轉化率提高了1.14倍。

本研究利用建立的優(yōu)化電擊轉化方法，首次將含有目的基因VgDGAT1a的植物真核表達載體VgDGAT1a-pCAMBIA3301轉化進入杜氏鹽藻細胞并且成功表達。關于轉VgDGAT1a基因鹽藻的油脂含量提高量、表型分析及其作用機理，我們將另作報道。本研究顯示，廣泛用于高等植物的表達載體pCAMBIA3301和除草劑抗性基因Bar同樣可以用于杜氏鹽藻等微藻的遺傳轉化。源于高等植物的基因和表達載體DNA元件的應用， 將擴寬微藻遺傳轉化所需的DNA元件和目的基因來源。這極有利于應用基于基因修飾的代謝工程技術對鹽藻等微藻進行目標代謝途徑組裝，以定向培育高效生產高值目標化合物工程微藻優(yōu)異株系。本文成功將控制TAG合成的關鍵酶基因DGAT1導入鹽藻，有望提高鹽藻細胞油脂積累量。未來進一步對鹽藻細胞脂肪酸合成和TAG積累途徑進行精細組裝，創(chuàng)育出光合效率高且富集優(yōu)質油脂的鹽藻新種質。這樣的工程鹽藻藻種可應用鹽堿化水體進行規(guī)模化養(yǎng)殖，進而商業(yè)化生產優(yōu)質生物燃油。這將促進鹽堿地資源化高值利用新途徑的創(chuàng)立和綠色生物能源產業(yè)鏈的拓展。

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