王曉丹，程蔚蘭，趙熙寧，史飛飛，杭偉，季春麗，李潤植

(山西農(nóng)業(yè)大學(xué) 分子農(nóng)業(yè)與生物能源研究所，山西 太谷 030801)

微藻是一類單細(xì)胞或細(xì)胞群體的光自養(yǎng)植物，光合固碳效率高，單位面積或體積生物量大，在適當(dāng)?shù)臈l件下，細(xì)胞內(nèi)能夠高水平積累具有獨(dú)特經(jīng)濟(jì)價(jià)值的化合物，可商業(yè)化開發(fā)利用[1]。這些高值化合物，包括應(yīng)對(duì)多種脅迫產(chǎn)生的主要代謝物，作為次級(jí)代謝物的類胡蘿卜素，多不飽和脂肪酸，和以三酰甘油形式儲(chǔ)存的油脂[2]。雨生紅球藻(H.pluvialis)是一種單細(xì)胞綠藻，細(xì)胞內(nèi)能合成積累高水平的蝦青素。蝦青素是一種高值、有超強(qiáng)抗氧化特性[3]的類胡蘿卜素，廣泛應(yīng)用于醫(yī)藥、保健營養(yǎng)品、化妝品、水產(chǎn)養(yǎng)殖、食品和飼料工業(yè)[4]。現(xiàn)今，微藻來源的產(chǎn)品(燃料、類胡蘿卜素、多不飽和脂肪酸、蛋白質(zhì)等)價(jià)格一般大約3～5倍于其他來源競爭品的市場價(jià)格[5]，但市場需求卻日益增加，特別是消費(fèi)者更青睞這些健康、安全、活性成分高的綠色天然產(chǎn)品。天然蝦青素正是這樣一種產(chǎn)品，其含量可高達(dá)雨生紅球藻細(xì)胞干重的5%[6]。雨生紅球藻規(guī)模化養(yǎng)殖和蝦青素產(chǎn)品已成為國內(nèi)外相關(guān)科學(xué)研究和企業(yè)研發(fā)的熱點(diǎn)[7,8]。已有研究表明，在適宜條件下雨生紅球藻生長迅速，但細(xì)胞積累蝦青素少，只有在脅迫條件下，細(xì)胞內(nèi)才高水平積累蝦青素[9]。這種生物量增加和蝦青素積累不同步的矛盾制約著雨生紅球藻的規(guī)?；a(chǎn)的經(jīng)濟(jì)效益。前人在氮源[10]、碳源[11]、微藻光生物反應(yīng)器[12]，雨生紅球藻分子發(fā)育[1,13]和培養(yǎng)模式(一步法、兩步法)[3,5]等方面做了大量的探索研究和實(shí)踐，但已有雨生紅球藻培養(yǎng)技術(shù)體系還未完全解決生物量增加和蝦青素積累不同步的問題。

為此，本文選用本實(shí)驗(yàn)室分離純化的雨生紅球藻(H.pluvialis)株系SX-HP08為試材，采用一步法培養(yǎng)體系，以BG-11為基礎(chǔ)培養(yǎng)基，分別以乙酸鈉和二氧化碳為碳源，添加少量乙醇，研究環(huán)境友好且價(jià)廉的乙醇[14]及其與碳源組合對(duì)雨生紅球藻生長及蝦青素積累的影響，以期獲得能夠促使雨生紅球藻生物量和蝦青素積累同步增長的簡易培養(yǎng)新方法，為雨生紅球藻高效規(guī)模化生產(chǎn)提供理論和技術(shù)支撐。

1 材料和方法

1.1 藻種

試驗(yàn)用藻種為本實(shí)驗(yàn)室從山西生境自然水體藻樣分離純化的雨生紅球藻(H.pluvialis)株系SX-HP08。

1.2 起始接種量及培養(yǎng)條件

用1 000 mL改進(jìn)的BG-11培養(yǎng)液，在2 500 mL燒瓶中培養(yǎng)用于試驗(yàn)的雨生紅球藻種子藻。在(22±1)℃和70 μmol·m-2·s-1的光照條件下，12 h光照：12 h黑暗的光周期，在人工氣候箱中培養(yǎng),每天定時(shí)搖瓶3次[15]。取指數(shù)生長期的雨生紅球藻接種，各處理每個(gè)2 500 mL三角瓶(裝有1 000 mL培養(yǎng)液)起始接種量均為1.0×105cells·mL-1。

1.3 培養(yǎng)基的成分

BG-11培養(yǎng)基(1 L)含1.5 g NaNO3，4 mg K2HPO4, 7.5 mg MgSO4·7H2O，6 mg C6H8O7，6 mg FeC6H5O7·NH4OH，1 mg Na2EDTA，36 mg CaCl2·2H2O，20 mg Na2CO3，2.86 mg H3BO3，1.81 mg MnCl2·4H2O，0.22 mg ZnSO4·7H2O，0.39 mg Na2MoO4·2H2O，0.08 mg CuSO4·5H2O，0.05 mg Co(NO3)2·6H2O。所用藥品均為分析純。用1 mol·L-1的HCL調(diào)節(jié)pH到7.1。培養(yǎng)基及器皿121 ℃，0.1 MPa，滅菌20 min。

1.4 試驗(yàn)所用主要儀器設(shè)備

紫外/可見分光光度計(jì)UV-1601:北京瑞利分析儀器有限公司；自動(dòng)滅菌器(進(jìn)口)MLS-3 781 L-PC:日本Panasonic公司; LED型頂置人工氣候箱RDN-560E-4: 中國寧波東南儀器有限公司；pH酸度計(jì)PHS-3C:中國上海儀電科學(xué)儀器股份有限公司；雙人單面潔凈工作臺(tái)SW-CJ-2FD：上海博訊公司；Beckman Allegra X-30R臺(tái)式冷凍離心機(jī):美國貝克曼﹒庫爾特公司; OLYMPUS BX53研究級(jí)正置熒光顯微成像系統(tǒng)：日本奧林巴斯公司；水分測定儀Sartorius Moisture Analyzer,MA150：德國賽多利斯公司；凍干機(jī)ALPHAI-4LDPLUS：德國Christ公司；SHB-III 循環(huán)水式多用真空泵：北京科偉永興儀器有限公司。

1.5 試驗(yàn)處理設(shè)置

對(duì)照組：BG-11培養(yǎng)基+1.5 g·L-1無水乙酸鈉[16]；BG-11培養(yǎng)基+1 h通入60 L占空氣體積為0.06%的CO2[15]。

處理組：在上述對(duì)照組中分別起始加入3%(v/v)無水乙醇，之后每培養(yǎng)3 d新加入1.5 mL無水乙醇[17]于藻液中。處理組標(biāo)記為：(BG-11培養(yǎng)基+1.5 g·L-1無水乙酸鈉)+乙醇；(BG-11培養(yǎng)基+1 h通入60 L占空氣體積為0.06%的CO2)+乙醇。

所有對(duì)照和處理組均培養(yǎng)14 d，每組試驗(yàn)重復(fù)6次。

1.6 藻細(xì)胞生長測定

生物量測定，取整數(shù)體積的藻液用玻璃砂芯真空泵抽濾后，通過水份測定儀(Sartorius Moisture Analyzer,MA150)測定干重法。細(xì)胞數(shù)量通過韋韜[15]的方法，使用改進(jìn)的鮑爾細(xì)胞計(jì)數(shù)器(血球計(jì))進(jìn)行細(xì)胞計(jì)數(shù)法測定。每48 h取樣測試。

1.7 藻細(xì)胞蝦青素含量測定

整數(shù)體積的雨生紅球藻藻液進(jìn)行離心，獲得的藻球進(jìn)行冷凍干燥。干燥后的細(xì)胞先用5% KOH(溶劑是30%的甲醇)溶液去除葉綠素。再用二甲亞砜反復(fù)提取直到藻球變?yōu)闊o色。通過分光光度計(jì)測定蝦青素含量[18]?；旌咸崛∥镌?90 nm處測定吸光度，二甲亞砜用于空白測定。每48 h取樣測試。計(jì)算蝦青素含量的公式如下：

C(mg·L-1)=(4.5×OD490×Va)/Vb

式中，C代表蝦青素含量；Va代表二甲亞砜的體積；Vb代表用于測量的雨生紅球藻樣品的體積。

1.8 數(shù)據(jù)處理

2 結(jié)果與分析

2.1 不同碳源和添加乙醇對(duì)雨生紅球藻生長的影響

不同碳源對(duì)照組和添加乙醇處理組連續(xù)培養(yǎng)14 d，每2 d取樣檢測藻液細(xì)胞密度(表1)。結(jié)果顯示，乙酸鈉為碳源對(duì)照組在各檢測時(shí)段的細(xì)胞密度均高于二氧化碳為碳源的對(duì)照組。添加乙醇的乙酸鈉處理組和添加乙醇的二氧化碳處理組在各檢測時(shí)段藻液細(xì)胞密度均顯著高于相應(yīng)的對(duì)照組(P<0.05)。尤其是乙酸鈉+乙醇處理組在第4天時(shí)，細(xì)胞密度上升到最大值(1.587×106cells·mL-1)，而乙酸鈉為碳源對(duì)照組細(xì)胞密度峰值(1.187×106cells·mL-1)出現(xiàn)在第8天。二氧化碳 + 乙醇處理組和二氧化碳為碳源的對(duì)照組最大細(xì)胞密度分別出現(xiàn)在第6天(1.236×106cells·mL-1)和第14天(7.9×105cells·mL-1)。顯然，添加乙醇顯著促進(jìn)了雨生紅球藻在培養(yǎng)初期階段的生長速率。

表1不同碳源和添加乙醇對(duì)雨生紅球藻生長的影響

Table1 Effect of different carbon and ethanol addition on growth ofH.pluvialis

時(shí)間/dTime細(xì)胞個(gè)數(shù)/104cells·L-1CellnumbersCO2CO2+ethanolsodiumacetatesodiumacetate+ethanol010±0.32a10.0±0.14a10.0±0.37a10.0±0.51a227±1.35d68.1±1.87b39.8±2.26c89.4±4.28a431±2.11d112.3±4.6b48.1±3.53c158.7±7.2a643±3.56d123.6±7.5b53.2±1.94c156.8±2.5a856±2.31c119.3±4.8b118.7±5.4c156.1±6.3a1063±1.87c118.7±6.7b117.3±6.2b148.9±9.8a1270±4.56c117.8±5.2b116.8±5.3b147.6±5.4a1479±3.91d115.9±8.2b109.5±8.4c146.4±3.4a

注：同行不同小寫字母表示在0.05水平下有顯著性差異。下同。

Note: Different small letters show significant difference at the 0.05 level in the same row.The same below.

2.2 不同碳源和添加乙醇對(duì)雨生紅球藻生物量的影響

表2顯示不同碳源和添加乙醇處理連續(xù)培養(yǎng)14 d雨生紅球藻生物量積累量。各處理雨生紅球藻生物量隨培養(yǎng)時(shí)間延長逐漸增加。在各測試階段，添加乙醇的乙酸鈉和添加乙醇的CO2處理組藻細(xì)胞生物量均顯著高于對(duì)照組(P<0.05)。在第14天時(shí)，處理組生物量(2.74 g·L-1和2.59 g·L-1)分別是乙酸鈉和CO2對(duì)照組生物量(0.92 g·L-1和0.7 g·L-1)的2.98倍和3.7倍。生物量高低順序?yàn)椋阂宜徕c+乙醇>CO2+乙醇>乙酸鈉>CO2。

表2不同碳源和添加乙醇對(duì)雨生紅球藻生物量的影響

Table2 Effect of different carbon and ethanol addition on biomass ofH.pluvialis

時(shí)間/dTime生物量/g·L-1BiomassCO2CO2+ethanolsodiumacetatesodiumacetate+ethanol00.12±0.02a0.12±0.01a0.12±0.01a0.12±0.03a20.18±0.01d0.56±0.05b0.29±0.01c0.98±0.04a40.21±0.03d0.87±0.04b0.40±0.03c1.37±0.04a60.39±0.01d1.37±0.03b0.47±0.01c1.75±0.19a80.48±0.03d1.50±0.05b0.69±0.09c1.95±0.26a100.59±0.05d1.98±0.14b0.72±0.05c2.27±0.21a120.68±0.04d2.38±0.13b0.89±0.04b2.67±0.30a140.70±0.01d2.59±0.10b0.92±0.04c2.74±0.06a

2.3 不同碳源和添加乙醇對(duì)雨生紅球藻蝦青素積累的影響

對(duì)各處理連續(xù)培養(yǎng)14 d不同時(shí)段雨生紅球藻細(xì)胞蝦青素含量測試結(jié)果(表3)顯示，添加乙醇的乙酸鈉和添加乙醇的CO2處理組藻細(xì)胞蝦青素含量在培養(yǎng)早期就高于對(duì)照組。從第8天開始，處理組細(xì)胞蝦青素積累大幅快速增加，而對(duì)照組藻細(xì)胞蝦青素積累緩慢。至培養(yǎng)14天時(shí)(表3和圖1)，處理組藻細(xì)胞蝦青素含量(96.1 mg·L-1和80.2 mg·L-1；3.51%和3.10%,干重)是乙酸鈉和CO2對(duì)照組藻細(xì)胞蝦青素含量(18.9 mg·L-1和10.0 mg·L-1；2.05%和1.43%,干重)的1.71倍和2.17倍(干重)，處理組與對(duì)照組差異達(dá)極顯著水平(P<0.01)。

表3不同碳源和添加乙醇對(duì)雨生紅球藻蝦青素積累的影響

Table3 Effect of different carbon and ethanol addition on astaxanthn accumulation inH.pluvialiscells

時(shí)間/dTime蝦青素產(chǎn)量/mg·L-1AstaxanthinyieldCO2CO2+ethanolsodiumacetatesodiumacetate+ethanol01.25±0.57a1.25±0.05a1.25±0.08a1.25±0.04a21.90±0.52d6.79±0.32b4.30±0.14c12.90±1.24a42.60±0.13d10.97±0.74b5.80±0.24c19.20±0.94a64.80±0.25d16.90±0.94b7.90±0.32c30.80±1.23a86.00±0.57d20.90±1.07b13.40±0.81c40.90±3.56a108.00±0.72d41.20±3.56b14.00±0.74b51.30±1.94a129.30±0.77d67.30±3.69b17.60±1.55b75.30±3.29a1410.00±0.50d80.20±4.28b18.90±0.62c96.10±8.40a

圖1 培養(yǎng)14 d時(shí)雨生紅球藻各處理組蝦青素含量Fig.1 Astaxanthin content in H. pluvialis cultured for 14 days in all treatments

3 討論與結(jié)論

商業(yè)化培養(yǎng)雨生紅球藻和生產(chǎn)蝦青素，通常采用氮、磷等營養(yǎng)素缺乏[10]、高密度光照[19]和高溫[20]誘導(dǎo)細(xì)胞合成積累蝦青素[21]。也有添加一些抑制劑和植物激素來提高蝦青素的生產(chǎn)量[22]。但是，這些逆境條件、因素亦嚴(yán)重阻抑藻細(xì)胞的生長和生物量的增加，規(guī)模化蝦青素生產(chǎn)的效益和成本欠佳。

在眾多有機(jī)物中，乙酸鈉最容易被雨生紅球藻細(xì)胞吸收和利用，能顯著促進(jìn)雨生紅球藻細(xì)胞的生長[11,23,24]。龍?jiān)傅萚25]研究表明，在光照條件下，乙酸鈉作為碳源，雨生紅球藻進(jìn)行兼養(yǎng)生長的生物量幾乎等于光合自養(yǎng)生長的生物量和異養(yǎng)生長的生物量的總和。Kang等[26]也報(bào)道乙酸鈉能促進(jìn)雨生紅球藻生長和蝦青素的積累。董慶霖等[27]研究指出乙酸鈉作為碳源導(dǎo)致雨生紅球藻代謝途徑所需氮源供應(yīng)不足而促進(jìn)蝦青素積累。本文研究結(jié)果顯示，與CO2作為碳源相比，乙酸鈉作為碳源不僅能顯著促進(jìn)雨生紅球藻細(xì)胞生長，而且提高了藻細(xì)胞蝦青素積累量,與前人的研究結(jié)果一致[23，28,29]。這些結(jié)果表明，乙酸鈉可作為雨生紅球藻規(guī)?；囵B(yǎng)生產(chǎn)蝦青素的良好碳源。

Guijarro 和Lagunas報(bào)道乙醇能通過簡單擴(kuò)散作用通過細(xì)胞質(zhì)膜，進(jìn)入細(xì)胞內(nèi)[30]?；趯?duì)人類和其他哺乳動(dòng)物的研究認(rèn)為，進(jìn)入細(xì)胞內(nèi)的乙醇可經(jīng)由乙醇脫氫酶在線粒體復(fù)合體Ⅰ和Ⅲ中產(chǎn)生ROS(活性氧)，導(dǎo)致細(xì)胞產(chǎn)生相應(yīng)脅迫[31]。Wen等[32]報(bào)道在兩步法培養(yǎng)雨生紅球藻的第二步缺氮培養(yǎng)基中加入乙醇能促進(jìn)蝦青素的積累。也有報(bào)道乙醇能提高紅發(fā)夫酵母(Phaffiarhodozyma)中蝦青素的產(chǎn)量[33]。黃達(dá)明等[34]報(bào)道乙醇對(duì)小球藻(Chlorella)的生長亦有促進(jìn)作用。

本研究發(fā)現(xiàn)，分別在乙酸鈉和CO2為碳源的培養(yǎng)基中添加少量乙醇能顯著提高雨生紅球藻生長速率和藻細(xì)胞內(nèi)蝦青素合成積累量，特別是乙酸鈉為碳源添加乙醇處理促進(jìn)藻細(xì)胞生長和蝦青素積累正效應(yīng)更顯著。綜合前人報(bào)道和本研究結(jié)果，證明環(huán)境友好和價(jià)廉的乙醇是繼乙烯的前體物(1-氨基環(huán)丙烷-1-羧酸[35])之后，又一種既能促進(jìn)雨生紅球藻生長又能促進(jìn)蝦青素積累的優(yōu)異促進(jìn)劑，可進(jìn)一步用于建立優(yōu)化的雨生紅球藻規(guī)?；囵B(yǎng)和蝦青素生產(chǎn)體系。

乙酸鈉是雨生紅球藻養(yǎng)殖的優(yōu)異碳源，在不同碳源培養(yǎng)基中添加少量乙醇可顯著促進(jìn)雨生紅球藻生長和藻細(xì)胞蝦青素積累。乙酸鈉為碳源添加乙醇可進(jìn)一步應(yīng)用于建立優(yōu)化的雨生紅球藻規(guī)?；囵B(yǎng)和蝦青素生產(chǎn)體系，減低蝦青素生產(chǎn)成本和提高生產(chǎn)效益。

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