錢莉莉，宋偉國，王 娟，申 震，吳大保，肖衛(wèi)華，單 革，周 穎

目的探討ΔNp63α在子宮頸癌細(xì)胞株中的轉(zhuǎn)錄調(diào)控機(jī)制。方法通過生物信息學(xué)分析ΔNp63α可能轉(zhuǎn)錄調(diào)控因子，構(gòu)建ΔNp63α啟動(dòng)子報(bào)告基因質(zhì)粒，在HEK293T及子宮頸癌細(xì)胞中通過報(bào)告基因檢測ΔNp63α及細(xì)胞信號轉(zhuǎn)導(dǎo)與轉(zhuǎn)錄激活因子(STAT3)對ΔNp63α轉(zhuǎn)錄水平的調(diào)控。通過STAT3的激活劑及抑制劑，檢測子宮頸癌細(xì)胞株中ΔNp63α的蛋白表達(dá)情況。通過Western blot檢測ΔNp63α的表達(dá)水平對子宮頸癌細(xì)胞株中P-STAT3的表達(dá)影響。結(jié)果① 成功構(gòu)建了含ΔNp63α 啟動(dòng)子的質(zhì)粒并通過酶切及測序驗(yàn)證；② 熒光素酶報(bào)告基因檢測系統(tǒng)顯示ΔNp63α、STAT3均可以激活ΔNp63α啟動(dòng)子的表達(dá)；③ Western blot結(jié)果顯示：STAT3激活劑及抑制劑分別可以激活或抑制ΔNp63α蛋白的表達(dá)水平；④ Western blot結(jié)果顯示：ΔNp63α蛋白的過表達(dá)或沉默可以抑制子宮頸癌細(xì)胞株中STAT3的磷酸化，而對正常細(xì)胞株HEK293T沒有相應(yīng)的調(diào)控作用。結(jié)論子宮頸癌細(xì)胞株中STAT3可以正性調(diào)控ΔNp63α的表達(dá)，而ΔNp63α的表達(dá)上調(diào)負(fù)反饋抑制STAT3的磷酸化，推測ΔNp63α可能通過與STAT3的復(fù)雜調(diào)控機(jī)制影響腫瘤細(xì)胞的惡性生物學(xué)行為。

子宮頸癌；ΔNp63α；STAT3；IL-6

p63是p53的家族成員之一，位于染色體3q27-3q29，根據(jù)其N端轉(zhuǎn)錄激活區(qū)的不同，分為TAp63和ΔNp63，根據(jù)其轉(zhuǎn)錄本3′端的選擇性剪切產(chǎn)生不同的C端：α、β、γ等[1-2]。研究[3]顯示，p63作為重要的轉(zhuǎn)錄因子，在不同的組織中，其發(fā)揮的功能也不盡相同。其中ΔNp63主要表達(dá)部位在復(fù)層上皮基底細(xì)胞，部分研究結(jié)果表明其在許多上皮性腫瘤中表達(dá)上調(diào)，如膀胱癌、非小細(xì)胞肺癌、鼻咽癌等；但大部分證據(jù)表明其在上皮細(xì)胞的發(fā)育及分化尤其是表皮細(xì)胞的形成中發(fā)揮著重要的功能[4]。該課題組前期研究[5-6]結(jié)果顯示p63在子宮頸癌組織及宮頸癌細(xì)胞株中的主要表達(dá)亞型ΔNp63α，且其表達(dá)的高低與宮頸癌分化程度密切相關(guān)。在宮頸癌細(xì)胞中ΔNp63的調(diào)控機(jī)制尚不清楚。

信號轉(zhuǎn)導(dǎo)與轉(zhuǎn)錄激活因子3(signal transducer and activator of transcription 3,STAT3)是JAK-STAT信號通路的重要成員，在信號轉(zhuǎn)導(dǎo)和轉(zhuǎn)錄激活上發(fā)揮了關(guān)鍵性的作用[7]。在不同的癌細(xì)胞系及原發(fā)腫瘤中STAT3的表達(dá)處于持續(xù)激活狀態(tài)[8]。最近研究[9]顯示, STAT3能夠負(fù)性調(diào)控腫瘤細(xì)胞中固有免疫和獲得性免疫的應(yīng)答，提示其在人類腫瘤中的功能有待于進(jìn)一步的研究[10]。該文探討了子宮頸癌中ΔNp63的轉(zhuǎn)錄調(diào)控機(jī)制。

1 材料與方法

1.1材料和試劑TaqDNA聚合酶、限制性內(nèi)切酶購自美國Thermo公司；T4 DNA連接酶購自日本TaKaRa公司；pGL3-basic系列質(zhì)粒、真核ΔNp63α質(zhì)粒及其對照質(zhì)粒PS10002購自美國Origene公司；大腸肝菌菌株E.coliDH5購自上海生工生物工程有限公司；脂質(zhì)體Lipofect2000、總RNA提取試劑TRIzol及逆轉(zhuǎn)錄試劑盒均購自美國Invitrogen公司；上、下游引物由上海生物工程有限公司合成；STAT3 Inhibitor購自美國Santa Cruz公司(SC-204304)，經(jīng)DMSO配成20 mmol/L分裝后-80 ℃保存?zhèn)溆?。白介?interleukin，IL)-6購自美國PeproTech公司,經(jīng)0.1% BSA的溶液溶解為1 mg/ml,分裝后-80 ℃保存?zhèn)溆?；雙熒光素酶報(bào)告基因試劑盒購自美國Promega公司；FastStart Universal SYBR Green Master(ROX)購自美國Roche公司；p63抗體購自美國GeneTex公司；STAT3、P-STAT3(Tyr-705)單抗購自美國Cell signaling公司；Western blot化學(xué)發(fā)光底物購自美國PIERCE公司；DNA膠回收試劑盒、PCR產(chǎn)物回收試劑盒、中小抽質(zhì)粒試劑盒購自美國Axygen公司。

1.2細(xì)胞株人源胚胎腎細(xì)胞(293T)、子宮頸鱗癌細(xì)胞株(SiHa、ME-180)細(xì)胞株及子宮頸腺癌細(xì)胞株(C-33A)購自上海細(xì)胞所。其中ME-180細(xì)胞培養(yǎng)液為McCoy’s 5A Medium Modified+10%胎牛血清，余細(xì)胞均為DMEM高糖培養(yǎng)基+10%胎牛血清。培養(yǎng)液均含有10 mmol/L 4-羥乙基哌嗪乙磺酸緩沖液和100 mg/L的氨芐青霉素和鏈霉素。

1.3方法

1.3.1ΔNp63α啟動(dòng)子序列的設(shè)計(jì)及合成 在轉(zhuǎn)錄起始位點(diǎn)向上900 bp獲得序列通過軟件Promotor 2.0 prediction 和Softberry FPROM/human promoter prediction軟件分析序列預(yù)測ΔNp63α啟動(dòng)子位點(diǎn)，預(yù)測到p53/p63 RE(-479～-465)及STAT3 RE(-557～540)。設(shè)計(jì)并合成其啟動(dòng)子引物：上游引物序列為5′-ACTGGGGGCAGACATTTCTCTA-3′,下游引物序列為5′-TGCAGTTGCTCTCCAGCGGTTA-3′。

1.3.2雙熒光素酶報(bào)告基因質(zhì)粒的構(gòu)建及鑒定 抽取SiHa細(xì)胞基因組為模板，引物為合成的上述序列，以TaqDNA聚合酶進(jìn)行PCR擴(kuò)增，擴(kuò)增時(shí)設(shè)計(jì)陰性對照。擴(kuò)增產(chǎn)物用1%的瓊脂糖膠中電泳，目的條帶符合預(yù)期后切膠回收，目的條帶回收產(chǎn)物及PGL3-Basic Vector分別用BglⅡ和MulⅠ雙酶切過夜，酶切產(chǎn)物清潔回收后，目的基因與載體摩爾比為1 ∶5，T4連接酶連接2 h。經(jīng)轉(zhuǎn)化及涂含氨芐抗性LB平板(100 mg/L)篩出陽性克隆，挑7個(gè)克隆搖菌小抽提取質(zhì)粒。各取2 μg進(jìn)行0.9%瓊脂糖膠中電泳，選取質(zhì)粒較完整者進(jìn)行單雙酶切鑒定，結(jié)果符合預(yù)期，于上海生工測序，測序正確，命名為ΔNp63α-promoter。

1.3.3細(xì)胞培養(yǎng) 將293T、C-33A、SiHa細(xì)胞接種于含10%FBS的高糖完全培養(yǎng)液(含青霉素100 U/ml 和鏈霉素100 μg/ml)中，ME-180細(xì)胞接種于含10%FBS的McCoy’s 5A完全培養(yǎng)基中，均置于37 ℃、 5% CO2體積的飽和濕度培養(yǎng)箱中進(jìn)行培養(yǎng)。用0.25% 的胰蛋白酶消化并進(jìn)行傳代，約3 d 傳代1次，取對數(shù)生長期的細(xì)胞進(jìn)行實(shí)驗(yàn)。

1.3.4重組質(zhì)粒的轉(zhuǎn)染 取對數(shù)生長期的細(xì)胞按照6×104個(gè)/孔的密度接種于24孔培養(yǎng)板中培養(yǎng)過夜，待細(xì)胞密度約為70%時(shí)進(jìn)行轉(zhuǎn)染，轉(zhuǎn)染前2 h換為不含雙抗的10%FBS的新鮮培養(yǎng)液。用減血清培養(yǎng)基稀釋PRL-TK質(zhì)粒后，再分別稀釋以下4組質(zhì)粒：PGL3-Basic與PS10001對照質(zhì)粒；ΔNp63α-promoter質(zhì)粒與PS10001對照質(zhì)粒；ΔNp63α質(zhì)粒與PGL3質(zhì)粒；ΔNp63α質(zhì)粒與ΔNp63α-promoter質(zhì)粒(每孔質(zhì)?？傎|(zhì)量為1 μg，其中PRL-TK Vector質(zhì)粒為0.1 μg)，每組質(zhì)粒做3個(gè)復(fù)孔。參照Lipofectamine 2000脂質(zhì)體轉(zhuǎn)染體系說明，在293T、SiHa、ME-180及C-33A中共轉(zhuǎn)染上述4組質(zhì)粒，轉(zhuǎn)染后8 h更換完全培養(yǎng)基。36 h后處理細(xì)胞進(jìn)行檢測。在檢測STAT3對ΔNp63α-promoter的作用時(shí)，則是在293T、SiHa、ME-180細(xì)胞系中共轉(zhuǎn)染ΔNp63α-promoter及PRL-TK Vector質(zhì)粒后，5% CO2、37 ℃培養(yǎng)8 h后換液，培養(yǎng)基中分別加入終濃度為100、200 ng/ml的IL-6及50、100 μmol/L的STAT3 Inhibitor。36 h后處理細(xì)胞檢測熒光素酶活性。

1.3.5雙熒光素酶報(bào)告基因活性測定 按照Promega雙熒光素酶檢測試劑盒提供的操作方法檢測在細(xì)胞中轉(zhuǎn)染不同質(zhì)粒后ΔNp63α-promoter 3′UTR 的熒光素酶的活性。用只含PBS 的孔將熒光檢測儀校準(zhǔn)，測量螢火蟲熒光素酶活性和海腎素?zé)晒馑孛富钚?，以螢火蟲熒光素酶活性/海腎素?zé)晒馑孛富钚缘闹底鳛闊晒馑孛富钚浴Ｒ灾晦D(zhuǎn)染空載體的細(xì)胞作為對照，并將該組的熒光素酶活性值進(jìn)行歸一化轉(zhuǎn)染ΔNp63α-promoter 3′UTR 質(zhì)粒組的熒光素酶活性為其相對值。

1.3.6細(xì)胞的處理及 Western blot檢測 待細(xì)胞密度為60%時(shí)，在培養(yǎng)液中加入不同濃度的IL-6和STAT3 Inhibitor，48 h后收細(xì)胞，采用含有蛋白酶抑制劑和磷酸酶抑制劑的RIPA裂解液提取蛋白，冰箱40 min,4 ℃、12 000 r/min離心15 min，取上清液分別至新的EP管中，對每個(gè)樣本進(jìn)行蛋白定量，確定蛋白上樣量。加蛋白上樣緩沖液(4×)和還原劑(1 mol/L DTT或b巰基乙醇)，比例為13 ∶5 ∶2。沸水煮樣5～10 min，短暫離心后用手彈勻。SD-SPAGE凝膠電泳，轉(zhuǎn)膜至PVDF膜上。5% BSA室溫封閉1 h，一抗孵育4 ℃過夜，室溫孵育二抗1 h。洗膜后加入適量顯影底物，化學(xué)發(fā)光檢測儀成像。

1.4統(tǒng)計(jì)學(xué)處理實(shí)驗(yàn)數(shù)據(jù)用GraphPad Prism 5.0 進(jìn)行單因素方差分析和作圖，兩組間比較采用t檢驗(yàn)，以P<0.05為差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。

2 結(jié)果

2.1ΔNp63α-promoter重組質(zhì)粒的測序鑒定ΔNp63α-promoter雙熒光素酶報(bào)告基因質(zhì)粒酶切鑒定后送于公司測序，測序結(jié)果為單一尖峰，與NCBI參考序列比對符合預(yù)期 (圖1)。證明目的基因已成功轉(zhuǎn)入PGL3-Control 載體中。

圖1 構(gòu)建ΔNp63α-promoter質(zhì)粒鑒定

A:ΔNp63α-promoter質(zhì)粒測序結(jié)果峰值;B:測序結(jié)果與ΔNp63α5’UTR區(qū)序列比對結(jié)果

2.2ΔNp63α對自身調(diào)控的影響將構(gòu)建的ΔNp63α-promoter質(zhì)粒與pGL3-Basic空載質(zhì)粒分別轉(zhuǎn)染至HEK293T、SiHa、ME-180及C-33A細(xì)胞中，進(jìn)行雙熒光素酶報(bào)告基因檢測，顯示與對照質(zhì)粒相比，ΔNp63α啟動(dòng)子質(zhì)粒活性在HEK293T、SiHa、ME-180及C-33A這4種細(xì)胞系中均顯著升高，升高倍數(shù)分別為1.7倍、2.8倍、2.4倍和1.75倍,差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P=0.009 7、0.008 3、0.006 1、0.005 3)。見圖 2。

2.3STAT3對ΔNp63α轉(zhuǎn)錄水平的影響分別將ΔNp63α-promoter質(zhì)粒轉(zhuǎn)染至293T、SiHa和ME-180細(xì)胞中，通過加入不同濃度的IL-6(100、200 ng/ml)和STAT3 Inhibitor(50、100 μmol/L)進(jìn)行刺激36 h，報(bào)告基因結(jié)果顯示STAT3在這3種細(xì)胞系中均能夠在轉(zhuǎn)錄水平上調(diào)控ΔNp63α的表達(dá)，其表達(dá)強(qiáng)度與IL-6的刺激濃度呈正相關(guān)性(P=0.008 3、0.009 3、0.004 2)，與STAT3 Inbitor的刺激濃度呈負(fù)相關(guān)性(P=0.007 4、0.003 7、0.004 6)，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。見圖3。

圖2 4種細(xì)胞中ΔNp63α質(zhì)粒對ΔNp63α啟動(dòng)子的活性影響

1：pCon+promoter ；2：ΔNp63α+promoter;與pCon+promoter比較:**P<0.01

2.4STAT3對ΔNp63α的蛋白水平影響分別用不同濃度的IL-6和STAT3 Inhibitor刺激細(xì)胞SiHa和ME-180細(xì)胞后, Western blot結(jié)果顯示IL-6在ME-180能夠激活ΔNp63α的表達(dá),但在SiHa細(xì)胞中激活作用不明顯。STAT3 Inhibitor均明顯可抑制2種細(xì)胞系中ΔNp63α的表達(dá)(圖 4)。

2.5ΔNp63α對STAT3的調(diào)控作用通過檢測293T、SiHa、ME-180細(xì)胞中ΔNp63α的表達(dá)水平，顯示與ME-180細(xì)胞相比，ΔNp63α在HEK293T及SiHa細(xì)胞中表達(dá)較低(圖5A)。將ΔNp63α瞬時(shí)轉(zhuǎn)染SiHa細(xì)胞中，顯示P-STAT3的表達(dá)水平明顯受到抑制；而將ΔNp63α干擾序列瞬時(shí)轉(zhuǎn)染ME-180細(xì)胞中，顯示P-STAT3的表達(dá)水平明顯激活(圖5B)。在正常細(xì)胞HEK293T中，瞬時(shí)轉(zhuǎn)染不同濃度的ΔNp63α，P-STAT3蛋白表達(dá)量并沒有明顯的變化(圖5C)。

圖3 不同細(xì)胞中STAT3對ΔNp63α啟動(dòng)子活性影響

A：293T；B：SiHa；C：ME-180;1：只轉(zhuǎn)染ΔNp63α-pro；2：轉(zhuǎn)染ΔNp63α-pro后加低濃度IL-6刺激；3：轉(zhuǎn)染ΔNp63α-pro后加高濃度IL-6刺激；4：轉(zhuǎn)染ΔNp63α-pro后加低濃度STAT3抑制劑刺激；5：轉(zhuǎn)染ΔNp63α-pro后加高濃度STAT3抑制劑刺激；與轉(zhuǎn)染ΔNp63α-pro后加高濃度IL-6刺激比較：**P<0.01；與轉(zhuǎn)染ΔNp63α-pro后加高濃度STAT3抑制劑刺激比較：##P<0.01

圖4 不同濃度的IL-6及STAT3 抑制劑對SiHa和ME-180細(xì)胞中ΔNp63α的表達(dá)影響

3 討論

p63作為重要的轉(zhuǎn)錄調(diào)控因子，主要選擇性的高表達(dá)于上皮組織中，是上皮組織分化調(diào)控的關(guān)鍵基因[11]。其突變可能導(dǎo)致部分關(guān)鍵信號分子中的RNA剪切發(fā)生巨大變化從而可導(dǎo)致缺趾畸形、外胚層發(fā)育不良，表皮生成障礙等[12]。雖然TAp63的亞型的功能與p53相似，能夠誘導(dǎo)細(xì)胞周期停滯及凋亡，但p63的抑癌功能尚存在爭議[13]。在宮頸鱗狀上皮和宮頸鱗癌細(xì)胞株中，p63主要的表達(dá)亞型為ΔNp63α，提示ΔNp63α在宮頸鱗狀上皮的發(fā)生發(fā)展具有重要的功能。

有研究[14]表明，在肝癌細(xì)胞中ΔNp63具有雙向的自我調(diào)控功能，ΔNp63α水平較低時(shí)，ΔNp63α可以通過結(jié)合到p53作用元件對自我進(jìn)行負(fù)性調(diào)控。反之，當(dāng)ΔNp63α水平較高時(shí)，其可以通過間接的方式正向的自我調(diào)控。在本研究中，首先通過生物信息學(xué)分析了ΔNp63α的啟動(dòng)子位點(diǎn)，顯示了其啟動(dòng)子區(qū)含有p63及STAT3的作用元件，并構(gòu)建了ΔNp63α報(bào)告基因質(zhì)粒。通過將報(bào)告基因質(zhì)粒轉(zhuǎn)染到HEK293T及宮頸癌細(xì)胞(SiHa、ME-180、C-333A)中進(jìn)行報(bào)告基因檢測，結(jié)果表明ΔNp63α及STAT3均能夠正性激活ΔNp63α的轉(zhuǎn)錄活性。通過加入IL-6及STAT3抑制劑刺激SiHa及ME-180細(xì)胞后，在蛋白水平，同樣顯示STAT3的激活可以促進(jìn)ΔNp63α的表達(dá)，而抑制STAT3的表達(dá)同時(shí)ΔNp63α的表達(dá)水平也顯著下調(diào)，進(jìn)一步確定了STAT3對ΔNp63α表達(dá)的正性調(diào)控作用。STAT3在許多癌細(xì)胞系及原發(fā)性腫瘤組織中處于持續(xù)激活狀態(tài)并能抑制細(xì)胞的凋亡，如前列腺癌、非小細(xì)胞肺癌等[7]。相反，在許多癌細(xì)胞中，抑制STAT3的表達(dá)可抑制細(xì)胞增殖及誘導(dǎo)其凋亡[15]。已有研究[16]表明JAK/STAT3信號通路的異常表達(dá)與細(xì)胞的惡性轉(zhuǎn)化密切相關(guān)。細(xì)胞因子可通過JAK1途徑刺激酪氨酸磷酸化，而Tyr-705的磷酸化作用可通過加強(qiáng)STAT3的二聚化、核轉(zhuǎn)運(yùn)及DNA結(jié)合作用進(jìn)而增強(qiáng)STAT3應(yīng)答基因的表達(dá)[17-18]。

本研究進(jìn)一步對ΔNp63α是否對STAT3具有調(diào)控作用進(jìn)行探討，首先在HEK293T和兩種不同的宮頸癌細(xì)胞系SiHa、ME-180細(xì)胞中檢測了ΔNp63α、P-STAT3的表達(dá)水平，本研究顯示在這兩種宮頸癌細(xì)胞系中ΔNp63α的表達(dá)水平與STAT3的活性呈負(fù)相關(guān)性。值得深思的是，在SiHa細(xì)胞系中過表達(dá)ΔNp63α，同時(shí)在ME-180細(xì)胞系中進(jìn)行ΔNp63α敲低，檢測STAT3的活性，同樣顯示ΔNp63α對STAT3呈負(fù)反饋調(diào)控。而在正常細(xì)胞HEK293T中，不同程度過表達(dá)ΔNp63α，P-STAT3的表達(dá)無明顯變化，推測可能由于正常細(xì)胞的微環(huán)境與腫瘤細(xì)胞的微環(huán)境的差異及基因表達(dá)譜不同有關(guān)。

圖5 ΔNp63α表達(dá)對P-STAT3(Tyr705)表達(dá)的影響

A：293T、SiHa、ME-180種細(xì)胞中ΔNp63α與P-STAT3本底表達(dá)水平；B：SiHa細(xì)胞中過表達(dá)ΔNp63α, P-STAT3表達(dá)下調(diào)和ME-180細(xì)胞中敲低ΔNp63α, P-STAT3表達(dá)上調(diào)；C：293T細(xì)胞中過表達(dá) ΔNp63α, P-STAT3表達(dá)無明顯變化

綜上所述，本研究明確了子宮頸癌細(xì)胞株中ΔNp63α的轉(zhuǎn)錄調(diào)控機(jī)制，并且顯示ΔNp63α在子宮頸癌細(xì)胞及正常細(xì)胞株中對STAT3的表達(dá)水平影響不同，推測ΔNp63α在子宮頸癌細(xì)胞株中可能具有抗腫瘤的作用。

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