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H2AX參與白血病細(xì)胞誘導(dǎo)NK細(xì)胞凋亡的研究

2018-03-15 01:59喬婷婷陸承榮段連寧
關(guān)鍵詞:細(xì)胞系磷酸化活化

喬婷婷,羅 淵, 陸承榮, 段連寧

自然殺傷(natural killer cell , NK)細(xì)胞是體內(nèi)重要的淋巴細(xì)胞亞群[1],可直接通過釋放細(xì)胞毒性顆粒包括顆粒酶和穿孔素等途徑來殺傷腫瘤細(xì)胞?;罨腘K細(xì)胞在免疫治療中,對多種腫瘤細(xì)胞具有明顯的殺傷作用[2]。而NK細(xì)胞在殺傷腫瘤細(xì)胞的同時(shí),自身又發(fā)生了什么改變,細(xì)胞最后的歸宿如何,仍然不詳。

相關(guān)研究[3]表明紅白血病細(xì)胞系K562采用Fas激活性抗體CH11作用于NK細(xì)胞可以誘導(dǎo)活化的NK細(xì)胞凋亡,其作用機(jī)制可能與FasL/Fas途徑有關(guān)。近年,組蛋白H2A家族的一個(gè)分子H2AX, 因?yàn)閰⑴c細(xì)胞核內(nèi)DNA分子的損傷修復(fù)作用而引起人們的關(guān)注。大量報(bào)道[4-5]表明,H2AX的主要功能受控于其C末端第139位點(diǎn)絲氨酸磷酸化作用(Ser139) 。H2AX的磷酸化修飾也被命名為γH2AX。 H2AX除了參與DNA分子損傷修復(fù)作用外,還存在一種新的功能,即調(diào)亡調(diào)控[4]。對于其是否參與通過誘導(dǎo)NK細(xì)胞凋亡致使白血病免疫逃逸,該研究對NK細(xì)胞凋亡和H2AX磷酸化及其之間的關(guān)系進(jìn)行檢測,初步探討H2AX是否參與白血病細(xì)胞誘導(dǎo)NK細(xì)胞凋亡。

1 材料與方法

1.1主要試劑和器材造血干細(xì)胞α-MEM培養(yǎng)基[含12.5%新生牛血清、12.5%馬血清、100 U/ml rh 白介素(interleukin,IL)-2];DMEM培養(yǎng)液購自美國HyClone公司;特級胎牛血清購自美國Gibco公司;Fas激活性抗體CH11、 PE AnnexinV凋亡檢測試劑盒和10×紅細(xì)胞裂解液均購自美國Bacton Dickinson公司;紅白血病細(xì)胞株K562由本實(shí)驗(yàn)中心常規(guī)保存和傳代。

1.2方法

1.2.1細(xì)胞培養(yǎng) ① NK-92細(xì)胞用α-MEM培養(yǎng)基培養(yǎng),調(diào)整純化的NK細(xì)胞密度為1×106/ml,每孔2 ml加于6孔培養(yǎng)板中,置于37 ℃、5%CO2培養(yǎng)箱中培養(yǎng),隔日換1次新鮮培養(yǎng)基,培養(yǎng)至培養(yǎng)皿中細(xì)胞數(shù)在80%左右開始實(shí)驗(yàn);② 白血病細(xì)胞K562培養(yǎng)用含5%胎牛血清、1%青鏈霉素的DMEM培養(yǎng)液按適當(dāng)濃度置于25 cm2培養(yǎng)皿中,在37 ℃、5%CO2培養(yǎng)箱中培養(yǎng),隔48 h換1次新鮮培養(yǎng)液,培養(yǎng)至對數(shù)生長期時(shí)開始實(shí)驗(yàn)。

1.2.2實(shí)驗(yàn)方法 ① 培養(yǎng)NK-92細(xì)胞,用Fas激活性抗體CH11模擬K562細(xì)胞系誘導(dǎo)凋亡,在不同CH11濃度(0、2.5、5、10、20 μg/ml)的培養(yǎng)條件下檢測細(xì)胞凋亡,該實(shí)驗(yàn)至少重復(fù)3次;② 在Fas激活性抗體CH11不同濃度(0、5、10、40、80 μg/ml)分別培養(yǎng)后,收集每組細(xì)胞,檢測H2AX的磷酸化水平,該實(shí)驗(yàn)至少重復(fù)3次。

1.2.3流式細(xì)胞術(shù)檢測NK細(xì)胞凋亡 干細(xì)胞α-MEM培養(yǎng)基培養(yǎng)NK92細(xì)胞,加入Fas激活性抗體CH11,按照上述實(shí)驗(yàn)方法用不同的濃度培養(yǎng)后,收集細(xì)胞上流式機(jī)檢測NK細(xì)胞凋亡。

1.2.4流式細(xì)胞術(shù)檢測H2AX磷酸化 在用Fas激活性抗體CH11作用于NK92細(xì)胞的同時(shí),收集不同濃度的細(xì)胞,重懸細(xì)胞使細(xì)胞密度達(dá)1×106~5×106cells/ml,37 ℃培養(yǎng)一段時(shí)間;取1×106個(gè)細(xì)胞/100 μl,先加入一抗混勻,置室溫下避光反應(yīng)30 min;室溫12 000 r/min離心4 min,棄上清液;100 μl PBS重懸細(xì)胞,再加入PE標(biāo)記熒光二抗混勻,室溫下反應(yīng)30 min:PBS再洗滌細(xì)胞2次,加入500 μl PBS重懸成單細(xì)胞懸液,上機(jī)檢測H2AX的磷酸化水平。

2 結(jié)果

2.1流式檢測K562細(xì)胞誘導(dǎo)活化NK92細(xì)胞的凋亡情況腫瘤細(xì)胞表面表達(dá)的Fas-L分子可以結(jié)合NK細(xì)胞表面的Fas受體,進(jìn)而反向攻擊NK細(xì)胞。為了模擬腫瘤靶細(xì)胞對NK細(xì)胞的誘導(dǎo)作用,本研究使用anti-Fas激活性抗體激活Fas-L/Fas信號轉(zhuǎn)導(dǎo)通路,然后檢測NK細(xì)胞凋亡。結(jié)果表明,隨著Fas激活性抗體CH11濃度的增加,K562細(xì)胞誘導(dǎo)NK細(xì)胞凋亡的情況明顯增加,且隨著時(shí)間的增加凋亡的情況更加顯著并呈劑量依賴性。CH11不同濃度下,NK92細(xì)胞的凋亡情況與不加抗體相比較差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(F=159.8,P<0.05)。見圖1、2。

圖1 CH11不同濃度下,NK92細(xì)胞的凋亡情況 與不加抗體比較:*P<0.05,**P<0.001

2.2流式檢測H2AX磷酸化為了驗(yàn)證anti-Fas 激活性抗體誘導(dǎo)NK細(xì)胞凋亡的同時(shí),H2AX 是否也發(fā)生磷酸化作用,本研究通過間接熒光標(biāo)記法對NK細(xì)胞內(nèi)磷酸化Ser139的H2AX 蛋白進(jìn)行標(biāo)記,然后用流式細(xì)胞儀檢測細(xì)胞平均熒光強(qiáng)度值。結(jié)果表明,NK細(xì)胞H2AX磷酸化呈anti-Fas劑量依賴性,即隨著anti-Fas劑量的升高,NK細(xì)胞凋亡越來越顯著,同時(shí)H2AX的磷酸化水平也越來越強(qiáng)。不同濃度下H2AX的磷酸化情況與0 μg/ml濃度比較差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(F=154.0,P<0.05)。見圖3、4。

圖2流式細(xì)胞術(shù)檢測不同CH11濃度下NK92細(xì)胞的凋亡

A:0 μg/ml; B:2.5 μg/ml;C:5 μg/ml;D:10 μg/ml;E:20 μg/ml

圖3 不同濃度下H2AX的磷酸化情況 與0濃度比較:*P<0.05,**P<0.001

3 討論

在體內(nèi),NK細(xì)胞通過活化作用聚集并浸潤到腫瘤組織內(nèi)部及病灶周圍,起到殺傷腫瘤的作用[6]。另外NK細(xì)胞對從腫瘤組織內(nèi)新生的腫瘤細(xì)胞同樣具有明顯的殺傷作用[7]。其腫瘤殺傷效應(yīng)機(jī)制研究較多,特別是NK細(xì)胞受體與靶細(xì)胞配體機(jī)制研究較為深入,即“Missing self”機(jī)制。然而NK細(xì)胞在執(zhí)行殺傷作用的同時(shí),本身也受到腫瘤細(xì)胞的調(diào)控從而導(dǎo)致凋亡。

關(guān)于活化的NK細(xì)胞與腫瘤細(xì)胞相互作用后,NK細(xì)胞的存活及狀態(tài)如何,人們較少重視。Dempsey et al[8]利用NK細(xì)胞群與黑色素瘤細(xì)胞Fol在不同時(shí)間點(diǎn)共孵育,發(fā)現(xiàn)活化NK細(xì)胞在發(fā)揮殺傷活性后,自身也隨之凋亡。

相關(guān)的實(shí)驗(yàn)結(jié)果也證實(shí)了這一點(diǎn):隨著NK細(xì)胞與白血病細(xì)胞相互作用時(shí)間延長,NK的凋亡率顯著增加,表明IL-2激活的NK細(xì)胞與紅白血病細(xì)胞系K562相互作用時(shí)K562可以誘導(dǎo)NK細(xì)胞凋亡[9]。這也與文獻(xiàn)[1,10]的研究結(jié)果一致。本文結(jié)果顯示,隨著體系中CH11濃度的升高,細(xì)胞凋亡明顯增加,并呈劑量依賴性 。

抑癌蛋白H2AX是組蛋白家族H2A的一個(gè)變異分子,是細(xì)胞核內(nèi)基因組的保護(hù)蛋白。如果缺乏組蛋白H2AX,基因組的穩(wěn)定性就會減弱,使得正常細(xì)胞和組織對腫瘤易感性增加,因而被認(rèn)為是一個(gè)腫瘤抑制因子或抑癌蛋白[11]。越來越多的證據(jù)表明,組蛋白H2AX調(diào)節(jié)腫瘤細(xì)胞調(diào)亡的功能與H2AX C末端磷酸化作用有關(guān)。相關(guān)研究[5]結(jié)果己經(jīng)證明,組蛋白H2AX在Ser139的磷酸化作用,在細(xì)胞調(diào)亡過程中起著關(guān)鍵調(diào)控作用。

本實(shí)驗(yàn)結(jié)果表明隨著CH11濃度的升高,細(xì)胞凋亡明顯增加,并呈劑量依賴性,與此同時(shí)H2AX的磷酸化水平也隨逐步增高,并呈劑量依賴性。因此,在白血病K562細(xì)胞誘導(dǎo)活化的NK92細(xì)胞凋亡的過程中,H2AX的磷酸化是參與其中的可能機(jī)制。

圖4 流式細(xì)胞術(shù)檢測H2AX的磷酸化水平 A:0 μg/ml;B:5 μg/ml;C:10 μg/ml ;D:20 μg/ml;E:40 μg/ml;F:80 μg/ml

結(jié)合前期研究[3,6],表明Fas/Fas-L與H2AX共同參與白血病誘導(dǎo)NK細(xì)胞凋亡。但是,H2AX的磷酸化作用是如何調(diào)控編輯凋亡途徑的尚需深入研究。

[1] Groth A, Kl?ss S, von Strandmann E P,et al. Mechanisms of tumorand viral immune escape from natural killer cell-mediatedsurveillance[J].J Innate Immtm,2011,3(4):344-54.

[2] Farag S S,Caligiuri M A.Human natural killer cell development andbiology[J].Blood Rev,2006,20(3):123-37.

[3] 曹 燕,段連寧,陸承榮,等.白血病細(xì)胞系K562可以誘導(dǎo)外周血NK細(xì)胞凋亡[J].南京醫(yī)科大學(xué)學(xué)報(bào),2012,32(9):1245-9.

[4] Zhang Y J, Lu C R,Cao Y,et al.Imatinib induces H2AX phosphorylation and apoptosis in chronic myelogenous leukemia cells invitroviacaspase-3/Mst1 pathway[J]. Acta Pharmacol Sin,2012,33(4): 551-7.

[5] Lu C, Shi, Y,Duan L,et al,MAPKs and Mst1/Caspase-3 pathways contribute to H2B phosphorylation during UVB-induced apoptosis[J].Sci China Life Sci,2010,53(6):663-8.

[6] Carlsten M,Malmbcrg K J,Ljunggen H G.Natural killer cell mediated lysis of freshly isolated human tumor cells[J]. Int J Cancer,2009,124(4):757-62.

[7] Pietra G,Manzini C,Vitale M,et al.Natural killer cells kiU human melanoma cells with characteristics of cancer stem cells[J].Int Immunol,2009,21(7):793-801.

[8] Dempsey E C,Newton A C,Mochly-Rosen D,et al.Protein kinaseC isozymes and the regulation of diverse cell responses[J].Am J Physiol Lung Cell Mol Physiol,2000,279(3):L429-38.

[9] Chen Y,Tian Q.The role of protein kinase cepsilon in neural signal transduction and neurogenic diseases[J].Front Med,2011,5(1):70-6.

[10] Minshall R D,Vandenbroucke E E,Holinstat M,et al.Role of protein kinase czeta in thrombin-induced RhoA activation and interendothelialgap formation of human dermal mierovessel endothelialcell monolayers[J].Mierovasc Res,2010,80(2):240-9.

[11] 羅 淵,索塔林,李 燕,等.白血病細(xì)胞系NK細(xì)胞配體表達(dá)及其對NK-92細(xì)胞殺傷敏感性的研究[J].中國免疫學(xué)雜志,2012,28(6):507-11.

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