王為民， 張?zhí)煳模?劉光興， 陳洪舉**， 毛雪微

(1. 中國(guó)海洋大學(xué)海洋環(huán)境與生態(tài)教育部重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室，山東 青島 266100； 2. 國(guó)家海洋局第一海洋研究所海洋氣候研究中心，山東 青島 266061；3. 山東省海水養(yǎng)殖研究所，山東 青島 266002； 4.中國(guó)海洋大學(xué)環(huán)境科學(xué)與工程學(xué)院，山東 青島 266100)

在過(guò)去的250年里，由于化石燃料燃燒、森林砍伐和其他人類活動(dòng)，大氣CO2平均濃度從工業(yè)革命前的280 μatm[1-2]升高到現(xiàn)在的395.26 μatm(NOAA, 2014)。大氣CO2濃度的升高造成海水pCO2升高、pH值降低和碳化學(xué)平衡改變，導(dǎo)致海洋酸化現(xiàn)象[1,3-4]。海洋酸化將會(huì)影響海洋生態(tài)系統(tǒng)平衡，影響海洋雙殼類的生長(zhǎng)發(fā)育和代謝[5-10]。

除了對(duì)貝類酶活性等生理活動(dòng)造成影響，海洋酸化還會(huì)對(duì)其潛沙等行為活動(dòng)產(chǎn)生影響。雙殼類生物幼體營(yíng)附著生活，具有潛沙的特性。研究發(fā)現(xiàn)魁蚶稚貝生活環(huán)境(如溫度等)的變化將顯著影響魁蚶稚貝的潛沙過(guò)程[15]。海洋貝類對(duì)潛沙行為的調(diào)控是其適應(yīng)環(huán)境變化的表現(xiàn)。關(guān)于CO2濃度升高導(dǎo)致的海洋酸化對(duì)貝類酶活性和潛沙行為影響的研究報(bào)道較少且機(jī)理不明。

魁蚶(Scapharcabroughtonii, Schrenck, 1876)在中國(guó)分布廣泛且其經(jīng)濟(jì)價(jià)值較高，是我國(guó)出口換匯率較高的水產(chǎn)品之一，在中國(guó)北方沿海地區(qū)開(kāi)展的人工繁育和養(yǎng)殖試驗(yàn)取得了很大的成就[16]。未來(lái)海洋酸化導(dǎo)致的海水CO2濃度升高可能會(huì)對(duì)魁蚶養(yǎng)殖業(yè)造成不利影響，而雙殼類早期生長(zhǎng)階段相比成體對(duì)CO2濃度升高更為敏感[17-18]。因此，開(kāi)展高CO2濃度條件對(duì)魁蚶早期發(fā)育階段的影響研究非常重要。本文采用CO2加富培養(yǎng)的方法，研究了高CO2濃度條件對(duì)魁蚶稚貝殼長(zhǎng)、潛沙過(guò)程和3種酶(SOD、CAT和AChE)活性的影響，以期為揭示海洋酸化對(duì)水產(chǎn)養(yǎng)殖業(yè)和海洋生態(tài)系統(tǒng)的影響提供基礎(chǔ)數(shù)據(jù)。

1 材料與方法

1.1 實(shí)驗(yàn)材料

實(shí)驗(yàn)用魁蚶稚貝(平均殼長(zhǎng)(17.20 ± 0.03) mm)由山東海水養(yǎng)殖研究所提供，在實(shí)驗(yàn)室暫養(yǎng)于連續(xù)充氣(DO>5.5 mg/L)的若干個(gè)水族箱(40 cm×35 cm×15 cm；溫度20 ℃；鹽度30)內(nèi)，暫養(yǎng)7 d。暫養(yǎng)和實(shí)驗(yàn)期間魁蚶稚貝每天喂食1次，喂食餌料為球等鞭金藻(Isochrysisgalbana)和三角褐指藻(Phacodactylumtricornutum)的混合藻液，保持培養(yǎng)水體藻細(xì)胞濃度小于105cells/L。

1.2 CO2加富對(duì)魁蚶稚貝潛沙過(guò)程的影響

30 cm×20 cm×15 cm規(guī)格的水族箱內(nèi)底部鋪設(shè)4～5 cm中砂(取自青島金沙灘)，裝入其容積約2/3體積的膜濾(GF/C 0.45 μm)滅菌(121 °C, 15 min)海水，并分別泵入過(guò)濾自然空氣(395 μatm CO2，2014年全球大氣CO2濃度平均水平)和含1 000 μatm CO2(2010年大氣平均CO2濃度預(yù)測(cè)水平)的過(guò)濾混合空氣，作為對(duì)照組和CO2組。通氣流量控制在0.1 L·min-1，CO2濃度和通氣流量由CO2加富器(CE100-6型，武漢瑞華儀器設(shè)備有限責(zé)任公司)控制。

于每個(gè)水族箱沙層(4～5 cm)表面自然放置魁蚶稚貝40只，觀察稚貝的潛沙行為，記錄稚貝的初潛時(shí)間(min)及1 h潛沙率。初潛時(shí)間為第1只魁蚶稚貝潛沙的時(shí)間，潛沙標(biāo)準(zhǔn)為魁蚶稚貝貝殼一半以上埋入沙中；潛沙率(%)=已潛沙個(gè)體數(shù)/總個(gè)體數(shù) × 100。實(shí)驗(yàn)進(jìn)行3次。

1.3 CO2加富對(duì)魁蚶稚貝3種酶活性的影響

取6個(gè)3 L三角瓶，分別加入2 L滅菌膜濾海水。每個(gè)培養(yǎng)容器頂面設(shè)置兩管：其中一個(gè)管設(shè)置為進(jìn)氣管，通入過(guò)濾自然空氣(對(duì)照組，3個(gè)平行)和1 000 μatm CO2的過(guò)濾混合空氣(CO2組，3個(gè)平行)，通氣流量控制在0.1 L·min-1。CO2濃度和通氣流量由CO2加富器控制；另一個(gè)管設(shè)置為出氣口，并于出氣口處設(shè)置針頭過(guò)濾器(MCE Syringe Filter，北京譜朋科技有限公司)以防止外界顆粒和微生物進(jìn)入培養(yǎng)系統(tǒng)。

每個(gè)培養(yǎng)容器中放置40只生長(zhǎng)狀態(tài)良好、絨毛完整的魁蚶稚貝，使其自然散落在培養(yǎng)容器底部。培養(yǎng)周期為14 d，溫度控制在20°C，每天喂食一次，喂食前換水(對(duì)照組培養(yǎng)容器加入提前泵入過(guò)濾空氣至pH值穩(wěn)定的滅菌海水，CO2組培養(yǎng)容器加入提前泵入含1 000 μatm CO2的混合空氣至pH值穩(wěn)定的滅菌海水)并清理糞便等雜質(zhì)。

每隔1天正午12：00取各培養(yǎng)容器內(nèi)水體(10 mL)，測(cè)量pH值(pH計(jì)，PB-10，Sartorius，德國(guó))和溶解無(wú)機(jī)碳(Dissolved inorganic carbon, DIC)濃度(總有機(jī)碳分析儀，TOC-VCPN，島津SHIMADZU，日本)；每個(gè)容器內(nèi)取3只生長(zhǎng)狀態(tài)良好的魁蚶稚貝，用游標(biāo)卡尺測(cè)其體長(zhǎng)，去殼后測(cè)其組織的SOD、CAT和AChE活性(U/mgprot)。3種酶活性均采用南京建成生物研究所生產(chǎn)的試劑盒測(cè)定。

1.4 數(shù)據(jù)處理

采用SPSS 19.0軟件進(jìn)行數(shù)據(jù)處理，采用Origin 8.5軟件繪圖。

2 結(jié)果與分析

2.1 培養(yǎng)環(huán)境的變化

實(shí)驗(yàn)過(guò)程中，CO2組pH值明顯降低，第2～14天CO2組pH值極顯著低于對(duì)照組(P<0.01)(見(jiàn)圖1(a))。CO2組培養(yǎng)水體平均pH降至7.71，比對(duì)照組培養(yǎng)過(guò)程中平均pH(8.30)低0.59。CO2濃度升高還引起了培養(yǎng)水體DIC濃度的上升。除第2天外，CO2組DIC濃度(平均值為34.50 mg/L)極顯著高于對(duì)照組(29.96 mg/L)(P<0.01)(見(jiàn)圖1(b))。

2.2 CO2加富對(duì)魁蚶稚貝潛沙過(guò)程的影響

CO2組魁蚶稚貝初次潛沙時(shí)間((5.7±0.5)min)相比對(duì)照組((7.8±1.3)min)顯著縮短(P< 0.01)，同時(shí)CO2組魁蚶稚貝1 h潛沙率((69.67 ± 5.13)%)相比對(duì)照組((61.33 ± 3.21)%)顯著升高(P< 0.01)(見(jiàn)圖2)。

2.3 CO2加富對(duì)魁蚶稚貝3種酶活性的影響

實(shí)驗(yàn)開(kāi)始時(shí)魁蚶稚貝殼長(zhǎng)為(17.20 ± 0.03) mm。在培養(yǎng)過(guò)程中，CO2組魁蚶稚貝殼未出現(xiàn)明顯生長(zhǎng)；對(duì)照組魁蚶稚貝殼長(zhǎng)在培養(yǎng)第4天起持續(xù)增長(zhǎng)，并從第8天開(kāi)始顯著高于CO2組(P<0.05)。實(shí)驗(yàn)結(jié)束時(shí)，CO2組魁蚶稚貝體長(zhǎng)((17.24 ± 0.02)mm)顯著低于對(duì)照組((17.37 ± 0.07) mm)(P<0.05)(見(jiàn)圖3 (a))。

(* P<0.05；** P<0.01, Error bar: SD)

(** P<0.01, Error bar: SD)圖2 CO2組和對(duì)照組魁蚶稚貝初潛時(shí)間和潛沙率Fig.2 The first burrowing time and burrowing rate of Scapharca broughtonii in CO2 and control treatments

對(duì)照組魁蚶稚貝SOD活性在培養(yǎng)過(guò)程中沒(méi)有明顯變化；CO2組魁蚶稚貝SOD活性在培養(yǎng)前4天內(nèi)出現(xiàn)上升，并于第4天時(shí)((24.30±1.08) U/mgprot)顯著高于對(duì)照組((19.40±2.45) U/mgprot)(P<0.05)，之后出現(xiàn)下降。第6天始2個(gè)組SOD活性無(wú)顯著差異(見(jiàn)圖3 (b))。

2個(gè)組魁蚶稚貝CAT活性在前4天均出現(xiàn)上升但無(wú)顯著差異。之后，CO2組魁蚶稚貝CAT活性基本不變，對(duì)照組魁蚶稚貝CAT活性在第6天始出現(xiàn)下降并低于CO2組，在第12天出現(xiàn)顯著差異(P<0.05)，其余時(shí)間均無(wú)顯著差異(見(jiàn)圖3(c))。

培養(yǎng)實(shí)驗(yàn)開(kāi)始后對(duì)照組魁蚶稚貝AchE活性開(kāi)始下降，而CO2組魁蚶稚貝AchE活性在培養(yǎng)過(guò)程中沒(méi)有明顯變化，兩實(shí)驗(yàn)組魁蚶稚貝AchE活性除在第10天出現(xiàn)顯著差異(P<0.05)外，在培養(yǎng)過(guò)程中無(wú)顯著差異(見(jiàn)圖3(d))。

3 討論

魁蚶無(wú)水管，其幼體營(yíng)附著生活，成長(zhǎng)過(guò)程中足絲退化，轉(zhuǎn)為埋棲生活并具有潛沙的特性，潛居后以殼的后緣在沙面形成通水孔[19]。海洋貝類對(duì)潛沙行為的調(diào)控是其適應(yīng)環(huán)境變化的表現(xiàn)，它們可以通過(guò)降低潛沙速率以降低耗能儲(chǔ)存能量[20]，也可以通過(guò)增高潛沙速率躲避不利環(huán)境條件如捕食者的攝食等[21]。有研究表明，魁蚶稚貝可以通過(guò)對(duì)其潛沙行為的調(diào)節(jié)適應(yīng)生活環(huán)境的變化[15]，本研究結(jié)果顯示，高CO2濃度條件下魁蚶稚貝初潛時(shí)間顯著減小，潛沙率顯著增加，潛沙行為受到促進(jìn)，說(shuō)明魁蚶稚貝趨于躲避CO2濃度升高造成的不利環(huán)境。

CO2濃度升高條件下，培養(yǎng)水體pH和DIC濃度等發(fā)生顯著變化，魁蚶稚貝殼生長(zhǎng)過(guò)程受到抑制(見(jiàn)圖3(a))。在高CO2濃度條件下，鈣化生物會(huì)降低其鈣化率，殼甚至?xí)芙鈁22]。雙殼類幼體的殼由較不穩(wěn)定的霰石(aragonite)組成[23]，成體殼的成分轉(zhuǎn)變?yōu)楦鼮榉€(wěn)定的方解石(calcite)[24]。因此，雙殼類幼體相比成體更容易在高CO2濃度條件下受到不利影響。有研究表明，海灣扇貝(Argopectenirradias)的幼體相比成體更易受到高CO2濃度條件的影響[17]，地中海貽貝(Mytilusgalloprovincialis)胚殼開(kāi)始形成的擔(dān)輪幼蟲(chóng)階段在酸化條件下會(huì)出現(xiàn)發(fā)育延遲現(xiàn)象，但擔(dān)輪幼蟲(chóng)階段以后不受海水酸化的影響[18]；然而，菲律賓蛤仔(Ruditapesphilippinarum)稚貝和成體的生長(zhǎng)在高CO2濃度條件下均無(wú)明顯變化[25]。本研究結(jié)果顯示，高CO2濃度條件下魁蚶稚貝殼的生長(zhǎng)較為緩慢，1 000 μatm CO2濃度已經(jīng)對(duì)魁蚶稚貝殼的正常生長(zhǎng)有不利影響。這表明酸化條件下，魁蚶等雙殼類生物的幼體和稚貝階段均可能受到不利影響。

高CO2濃度還對(duì)魁蚶稚貝的生理活動(dòng)造成影響，研究表明,在潮汐出現(xiàn)時(shí)海水CO2濃度增加，海洋無(wú)脊椎動(dòng)物體內(nèi)瓣膜關(guān)閉、呼吸作用增強(qiáng)[33-34]，同時(shí)體內(nèi)血淋巴(Hemolymph)pH值降低[26]，從而導(dǎo)致其抗氧化酶活性的升高；潮汐的周期性還使得潮間帶海洋無(wú)脊椎動(dòng)物體內(nèi)抗氧化酶活性存在周期性變化[32]。CO2組和對(duì)照組魁蚶稚貝的3種酶(SOD，CAT和AChE)活性雖在實(shí)驗(yàn)過(guò)程中無(wú)明顯差異，但CO2組3種酶活性的平均值均略高于對(duì)照組， 1 000 μatm CO2濃度條件下魁蚶稚貝可能已開(kāi)始通過(guò)改變自身酶活性來(lái)適應(yīng)不利的環(huán)境變化。本文推測(cè)如果CO2濃度繼續(xù)升高(>1 000 μatm)，魁蚶稚貝3種酶活性將在一定范圍內(nèi)繼續(xù)升高。雙殼類對(duì)CO2濃度變化調(diào)節(jié)能力有限，CO2濃度升高將導(dǎo)致線粒體活性加強(qiáng)，線粒體中電子傳遞鏈(Electron Transport Chain，ETC)正常運(yùn)轉(zhuǎn)受到影響[27-28]，而線粒體是ROS產(chǎn)生的主要場(chǎng)所[29]，ROS的產(chǎn)量的增加使得貝類抗氧化基因表達(dá)量出現(xiàn)上調(diào)[5]；而SOD和CAT活性增強(qiáng)可以使細(xì)胞中的ROS及時(shí)清除，使生物細(xì)胞免受環(huán)境變化導(dǎo)致的ROS產(chǎn)量升高的不利影響，保護(hù)生物細(xì)胞[30-31]。因而在本研究中升高的pCO2使魁蚶稚貝體內(nèi)氧化脅迫增強(qiáng)，為了使自身細(xì)胞免受大量ROS的不利影響，魁蚶稚貝SOD和CAT活性出現(xiàn)一定程度的升高。

((a)體長(zhǎng)；(b)超氧化物歧化酶；(c)過(guò)氧化氫酶；(d)乙酰膽堿酯酶。(a)Body length; (b)SOD; (c)CAT; (d)AchE.)(*P<0.05, **P<0.01, Error bar: SD.)

圖3 CO2組和對(duì)照組魁蚶稚貝體長(zhǎng)和3種酶活性變化曲線
Fig.3 The shell length and SOD, CAT, AChE activity ofScapharcabroughtoniiin CO2and control treatments

AChE的主要作用是通過(guò)催化水解神經(jīng)遞質(zhì)乙酰膽堿(Acetylcholine, ACh)來(lái)維持神經(jīng)沖動(dòng)的正常傳遞[12]，AChE活性的升高意味著神經(jīng)沖動(dòng)傳遞的增加。本研究中魁蚶稚貝在面對(duì)CO2濃度升高條件下，潛沙過(guò)程受到促進(jìn)，本文推測(cè)魁蚶稚貝通過(guò)增加ACh來(lái)增加了神經(jīng)沖動(dòng)的傳遞，其潛沙行為活動(dòng)受到促進(jìn)，而ACh的增加導(dǎo)致了AChE活性的升高。

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