李靖靖，李紅梅

（鄒平縣綜合檢驗(yàn)檢測(cè)中心，山東鄒平 256200）

近年來(lái)，隨著臨床上抗生素的普遍應(yīng)用，很多感染性病菌的耐藥性也逐漸增強(qiáng)，致使抗生素的劑量不斷加大，如耐青霉素的肺炎球菌、耐萬(wàn)古霉素的腸球菌、耐甲氧西林的金黃色葡萄球菌等[1-2]。因此，迫切需要新型的抗生素來(lái)抵抗這些耐藥菌株的感染，而普那霉素則成了新型抗生素的首選。普那霉素屬于革蘭氏陽(yáng)性菌素類抗生素，由始旋鏈霉菌發(fā)酵產(chǎn)生，可以通過(guò)與核糖體結(jié)合從而抑制蛋白的合成，對(duì)大多數(shù)革蘭氏陽(yáng)性菌和部分革蘭氏陰性菌有較強(qiáng)的抑制作用，是萬(wàn)古霉素的替代藥物[3]。更重要的是，對(duì)普那霉素制劑的臨床應(yīng)用證明，只有極少數(shù)的細(xì)菌會(huì)對(duì)其產(chǎn)生微弱的耐藥性，因此普那霉素在抵抗多重耐藥菌方面起到了重要作用，具有廣闊的市場(chǎng)前景[4]。

目前，國(guó)內(nèi)對(duì)普那霉素的研究較少，菌株發(fā)酵尚處于較低的水平，一般效價(jià)不超過(guò)2 000 U/mL，發(fā)酵單位不超過(guò)1 500 mg/L[3]。為了進(jìn)一步提升普那霉素的發(fā)酵水平，降低生產(chǎn)成本，試驗(yàn)對(duì)1株普那霉素產(chǎn)生菌Streptomyces pristinaespiralis LS15進(jìn)行了Genome Shuffling的育種研究，以進(jìn)一步提升其發(fā)酵能力，為后續(xù)研究工作提供性能優(yōu)良的菌株。

1 材料與方法

1.1 試驗(yàn)材料

普那霉素產(chǎn)生菌S.pristinaespiralis LS15，土壤中篩選并由鄒平縣綜合檢驗(yàn)檢測(cè)中心保藏。

瓊脂培養(yǎng)基：可溶性淀粉10 g/L，黃豆餅粉2 g/L，酵母抽提物1 g/L，瓊脂20 g/L，初始pH值7.0，121℃滅菌20 min。

再生培養(yǎng)基：瓊脂培養(yǎng)基中加入蔗糖105 g/L。

發(fā)酵培養(yǎng)基：酵母抽提物6 g/L，葡萄糖30 g/L，KH2PO4·2H2O1.2 g/L，（NH4）2SO48 g/L，K2HPO4·2H2O 1.5 g/L，MgSO4·7H2O 0.8 g/L，F(xiàn)eSO4·7H2O 0.05 g/L，ZnSO4·7H2O 0.05 g/L，pH值7.0，115℃滅菌20 min。

1.2 試驗(yàn)方法

1.2.1 亞硝基胍（NTG） 誘變

在分析天平上稱取NTG 30 mg，用pH值7.0的無(wú)菌磷酸鹽緩沖液30 mL溶解，則NTG溶液質(zhì)量濃度為1 mg/mL。刮取1環(huán)孢子，用無(wú)菌磷酸緩沖液10 mL混合振蕩，分散均勻，再將孢子質(zhì)量濃度稀釋為107～108個(gè)/mL。吸取孢子懸液及NTG溶液各2 mL，于試管中混合均勻，則NTG的終質(zhì)量濃度為0.5 mg/mL，將試管置于30℃水浴中，每隔10 min取樣0.5 mL，稀釋100倍后涂布平板。

1.2.2 發(fā)酵培養(yǎng)

從瓊脂培養(yǎng)基上刮取孢子2環(huán)，無(wú)菌條件下接入50 mL/250 mL的種子培養(yǎng)基中，于30℃，200 r/min條件下?lián)u床培養(yǎng)30 h。每株菌接入3個(gè)搖瓶，普那霉素產(chǎn)量取三者的平均值。

1.2.3 原生質(zhì)體制備及融合

（1） 各NTG突變株的孢子接入發(fā)酵培養(yǎng)基，于30℃，200 r/min條件下培養(yǎng)30 h。

（2） 吸取種子液10 mL轉(zhuǎn)入無(wú)菌離心管中，以轉(zhuǎn)速5 000 r/min離心5 min。

（3）將上清液倒掉，加入10 mL無(wú)菌水，振蕩洗滌菌體，重復(fù)離心棄上清液，再改用10 mLPB高滲液洗滌菌體2次，最后加入5 mLPB液，混勻菌絲體。

（4） 用質(zhì)量濃度為5 mg/mL溶菌酶制備原生質(zhì)體，在30℃條件下保溫90 min，期間每隔10 min輕輕振蕩混勻。

（5）將原生質(zhì)體分成2份，1份在70℃條件下保溫30 min鈍化，1份在紫外線下照射60 min鈍化。

（6） 2份原生質(zhì)體再次混合均勻，以5 000 r/min轉(zhuǎn)速離心15 min，倒掉上清液，加入PB高滲液1 mL，用移液槍輕輕吹洗沉淀，使其分散均勻。

（7） 加入質(zhì)量分?jǐn)?shù)為40%的PEG6000溶液3 mL，輕輕吹洗，使其混合均勻，然后將懸液置于37℃水浴中15 min，進(jìn)行原生質(zhì)體融合。

（8）用PB高滲液稀釋懸液，雙層瓊脂法涂布再生平板。

1.3 發(fā)酵液中普那霉素含量測(cè)定

高效液相色譜法測(cè)定發(fā)酵液中普那霉素含量[3]。

1.4 酶活測(cè)定

己糖激酶（Hexokinase，HK）、丙酮酸激酶（Pyru vatekinase，PK）、天冬氨酸激酶（Aspartokinase，AK）、檸檬酸合成酶（Citrate synthase，CS） 的酶活測(cè)定參照相關(guān)文獻(xiàn)[5-8]。

2 結(jié)果與分析

2.1 NTG誘變劑量的確定

NTG是一種烷化劑，具有多個(gè)活性烷基，它們?nèi)菀兹〈鶧NA中的活潑氫原子，使DNA分子上的堿基和部分磷酸被烷化，DNA復(fù)制時(shí)導(dǎo)致堿基配對(duì)發(fā)生錯(cuò)誤而引發(fā)突變，因而素有“超誘變劑”之稱。試驗(yàn)采用質(zhì)量濃度為0.5 mg/mL的NTG溶液對(duì)S.pristinaespiralis LS15的孢子處理不同時(shí)間，以不經(jīng)誘變的孢子作為對(duì)照，涂布瓊脂平板計(jì)算誘變致死率。

NTG誘變S.pristinaespiralis LS15孢子的致死率曲線見圖1。

圖1 NTG誘變S.pristinaespiralis LS15孢子的致死率曲線

根據(jù)圖1可以看出，隨著NTG處理時(shí)間的延長(zhǎng)，菌株孢子的致死率也隨之增加，一般選擇致死率為80%左右為宜，所以將NTG的處理時(shí)間確定為70 min。

2.2 鏈霉素抗性濃度的確定

普那霉素是一種次級(jí)代謝產(chǎn)物，在放線菌產(chǎn)次級(jí)代謝產(chǎn)物的誘變研究中，“核糖體工程育種”是普遍采用的一種方法。微生物的核糖體是蛋白和酶的合成機(jī)器，其某些特定位點(diǎn)會(huì)被一些抗生素所結(jié)合從而降低活性，如鏈霉素、慶大霉素、利福霉素等，但是當(dāng)編碼核糖體的基因發(fā)生突變后，核糖體不再與抗生素結(jié)合，或者即使結(jié)合了也不會(huì)降低活性，菌株表現(xiàn)出抗性，從而導(dǎo)致次級(jí)代謝產(chǎn)物的過(guò)量合成[9-10]?；谏鲜鲈?，試驗(yàn)選取鏈霉素作為抗性指標(biāo)對(duì)S.pristinaespiralis LS15進(jìn)行誘變篩選。

S.pristinaespiralis LS15對(duì)鏈霉素的抗性見表1。

當(dāng)鏈霉素質(zhì)量濃度達(dá)到4 mg/mL時(shí)幾乎完全抑制了S.pristinaespiralis LS15的生長(zhǎng)。

2.3 誘變及篩選

表1 S.pristinaespiralis LS15對(duì)鏈霉素的抗性

根據(jù)以上的試驗(yàn)結(jié)果，對(duì)S.pristinaespiralis LS15進(jìn)行了基于鏈霉素抗性的NTG誘變及搖瓶篩選。采用質(zhì)量濃度為0.5 mg/mL的NTG溶液對(duì)孢子處理70 min后，涂布梯度范圍為0～10 mg/mL的鏈霉素抗性平板。在前期試驗(yàn)中已經(jīng)證實(shí)S.pristinaespiralis LS15對(duì)鏈霉素的臨界質(zhì)量濃度為4 mg/mL，但經(jīng)過(guò)NTG誘變后，在梯度平板的中上部（可以認(rèn)為鏈霉素的質(zhì)量濃度范圍為5～10 mg/mL） 有部分菌株能夠生長(zhǎng)，說(shuō)明該區(qū)域的菌株獲得了鏈霉素抗性，屬于突變菌株，證明了NTG誘變的有效性。

菌株在鏈霉素抗性平板上呈梯度分布見圖2。

圖2 菌株在鏈霉素抗性平板上呈梯度分布

從高質(zhì)量濃度鏈霉素的區(qū)域挑選了生長(zhǎng)速度較快的50個(gè)單菌落，轉(zhuǎn)接到常規(guī)瓊脂培養(yǎng)基中上培養(yǎng)，使其正常產(chǎn)孢子。每株菌接入3個(gè)搖瓶進(jìn)行發(fā)酵，測(cè)定普那霉素含量以篩選正向突變菌株。最終獲得了6株普那霉素?fù)u瓶產(chǎn)量提高的菌株，分別為1.42，1.39，1.41，1.46，1.41，1.43 g/L，相比于初始菌株的1.12 g/L提高幅度為24.1%～30.3%。該結(jié)果說(shuō)明不僅NTG誘變是有效的，以鏈霉素作為抗性指標(biāo)也是切實(shí)可行的，該6株產(chǎn)量提高菌株可以作為后續(xù)的Genome Shuffling育種的出發(fā)菌株。

NTG誘變后篩選出的普那霉素產(chǎn)量提高菌株見圖3。

圖3 NTG誘變后篩選出的普那霉素產(chǎn)量提高菌株

2.4 Genome Shuffling育種

將NTG誘變篩選得到的6株普那霉素產(chǎn)量提高菌株的孢子分別接入發(fā)酵培養(yǎng)基，培養(yǎng)30 h后獲得種子。將6株菌的菌絲混合后制備原生質(zhì)體，按照既定的方法進(jìn)行原生質(zhì)體的滅活、融合及再生，該過(guò)程為第1輪Genome Shuffling。

菌絲及原生質(zhì)體的形態(tài)見圖4。

圖4 菌絲及原生質(zhì)體的形態(tài)

在第1輪Genome Shuffling的原生質(zhì)體再生過(guò)程中，選取再生速度、生長(zhǎng)速度及菌絲孢子化速度較快的50個(gè)單菌落轉(zhuǎn)接常規(guī)瓊脂培養(yǎng)基，使其正常產(chǎn)孢子，然后每株菌接入3個(gè)搖瓶進(jìn)行發(fā)酵，測(cè)定普那霉素含量以篩選產(chǎn)量提高菌株并最終獲得了4株，搖瓶產(chǎn)量分別為1.62，1.69，1.61，1.66 g/L。將這4株菌作為出發(fā)菌株，再次接種培養(yǎng)制備原生質(zhì)體，重復(fù)第1輪Genome Shuffling的過(guò)程，搖瓶篩選獲得了5株普那霉素產(chǎn)量進(jìn)一步提高的菌株，分別為1.92，1.89，1.94，1.94，1.86 g/L。再次重復(fù)進(jìn)行第3輪Genome Shuffling，最終又篩選得到了2株普那霉素產(chǎn)量提升的融合子，搖瓶產(chǎn)量分別為2.06，2.15 g/L，相比于出發(fā)菌株的1.12 g/L提高幅度高達(dá)91.5%。

Genome Shuffling選育S.pristinaespiralis LS15的過(guò)程見圖5。

圖5 Genome Shuffling選育S.pristinaespiralis LS15的過(guò)程

2.5 高產(chǎn)融合子與初始菌株的胞內(nèi)酶活測(cè)定

為了初步解釋Genome Shuffling育種獲得的融合子S.pristinaespiralis GS3-26相比初始菌株LS15高產(chǎn)普那霉素，試驗(yàn)選取了菌株代謝途徑中的一些關(guān)鍵酶進(jìn)行了酶活測(cè)定，這些酶有糖酵解途徑（EMP途徑） 中的己糖激酶（Hexokinase，HK） 和丙酮酸激酶（Pyruvate kinase，PK），二氨基庚二酸途徑（DAP途徑）中的天冬氨酸激酶（Aspartokinase，AK）和三羧酸循環(huán)過(guò)程中（TCA）的檸檬酸合成酶（Citrate synthase，CS）。GS3-26與LS15在發(fā)酵培養(yǎng)基中分別培養(yǎng)30 h后，相同處理方式下測(cè)定4種酶的活力。

菌株S.pristinaespiralis LS15與GS3-26的酶活比較見表2。

表2 菌株S.pristinaespiralis LS15與GS3-26的酶活比較

普那霉素的分子骨架由很多氨基酸殘基聚合而成，因此菌體細(xì)胞中氨基酸的合成對(duì)于普那霉素的產(chǎn)量有重要的影響[4]，而氨基酸的合成主要來(lái)自TCA循環(huán)。從表2的酶活比較中可以看出，高產(chǎn)融合子GS3-26的CS酶活在相比LS15提高了55.2%，CS作為TCA循環(huán)中的第1個(gè)關(guān)鍵酶，其酶活增強(qiáng)說(shuō)明TCA循環(huán)在GS3-26中得到了強(qiáng)化。賴氨酸主要由DAP途徑合成，而DAP途徑中的關(guān)鍵酶AK在GS3-26中的活性也提高60.7%。TCA循環(huán)的增強(qiáng)勢(shì)必需要上游EMP途徑的增強(qiáng)，通過(guò)酶活比較可知，EMP途徑中的HK與PK也確實(shí)有不同程度的酶活提升。

3 討論

Genome Shuffling，也叫基因組改組或者基因組重排，該法首先以傳統(tǒng)方法誘變菌株，篩選獲得若干表型提高的突變株，然后將這些菌株混合后進(jìn)行原生質(zhì)體融合，并且重復(fù)多輪次，因而使各突變基因隨機(jī)發(fā)生重組，最后篩選出目標(biāo)菌株。Genome Shuffling育種的高效性已經(jīng)在提高泰樂菌素[11]、羥基酸 （HCA）[12]、原始霉素[13]、ε-聚賴氨酸[14]產(chǎn)量等研究中得到了驗(yàn)證，在提高乳酸菌的耐葡萄糖、耐乳酸能力，提高酵母菌耐高溫、耐乙醇能力等方面也發(fā)揮了巨大的作用[15]。從理論上而言，Genome Shuffling是整個(gè)基因組水平上的循環(huán)重組，可以將多個(gè)親株的優(yōu)良性狀通過(guò)多輪的隨機(jī)融合集中于同一個(gè)細(xì)胞中，與基因/代謝工程相比，其突出優(yōu)點(diǎn)是不必了解整個(gè)基因組的序列數(shù)據(jù)和代謝網(wǎng)絡(luò)的信息。本研究中，作者采用亞硝基胍誘變結(jié)合鏈霉素抗性對(duì)S.pristinaespiralis LS15產(chǎn)普那霉素進(jìn)行了3輪Genome Shuffling育種，最終獲得的融合子GS3-26，搖瓶發(fā)酵產(chǎn)量達(dá)到2.15 g/L，比原始菌株提高了91.5%，再次證明了Genome Shuffling育種的高效性，后續(xù)研究工作需要聚焦于培養(yǎng)基優(yōu)化及發(fā)酵工藝調(diào)控方面，以進(jìn)一步提升普那霉素的發(fā)酵水平。

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