卞煒，秦文熠（.重慶市永川區(qū)中醫(yī)院康復(fù)科4060；.重慶醫(yī)科大學(xué)附屬第一醫(yī)院中西醫(yī)結(jié)合科，重慶 40006）

腦水腫損傷是缺血性腦血管疾病潛在的一種嚴(yán)重并發(fā)癥[1]，而腦水腫是引發(fā)大面積腦梗死高死亡率和高致殘率的重要原因[2]。研究表明，水通道蛋白4（AQP4）是中樞神經(jīng)系統(tǒng)最主要的水通道蛋白，廣泛存在于星形膠質(zhì)細(xì)胞[3]，其在腦缺血所致腦水腫的發(fā)病機(jī)制中占據(jù)著重要地位[4]。星形膠質(zhì)細(xì)胞作為中樞神經(jīng)系統(tǒng)的主要支持成分，在腦缺血發(fā)生后，過度激活的星形膠質(zhì)細(xì)胞可通過釋放谷氨酸[5]、促炎性細(xì)胞因子誘導(dǎo)型一氧化氮合酶（iNOS）、腫瘤壞死因子 α（TNF-α）等[6]分泌加重再灌注損傷。研究表明，AQP4不僅可介導(dǎo)星形膠質(zhì)細(xì)胞調(diào)節(jié)水在腦、血管和腦室之間的交換，還參與了腦缺血發(fā)生后星形膠質(zhì)細(xì)胞的激活[7-8]。針刺作為中國(guó)傳統(tǒng)的非藥物治療手段，對(duì)腦缺血/再灌注炎性損傷具有顯著的臨床效應(yīng)[9]，但其抗炎機(jī)制尚不明確。本研究著重探討電針能否通過調(diào)節(jié)AQP4的表達(dá)減輕腦水腫及星形膠質(zhì)細(xì)胞活化，以期深入探討電針治療減輕局灶腦缺血/再灌注后腦損傷的可能機(jī)制。

1 材料與方法

1.1 材料

1.1.1 實(shí)驗(yàn)動(dòng)物 清潔級(jí)雄性SD大鼠60只，體重250～300 g，由重慶醫(yī)科大學(xué)動(dòng)物中心[SCXK（渝）2012-0002]提供。

1.1.2 主要試劑與儀器 AQP4多克隆抗體（Abcam公司）、神經(jīng)膠質(zhì)纖維酸性蛋白（GFAP）多克隆抗體（Abcam公司）、免疫熒光定量PCR相關(guān)試劑（Takara公司）、AQP4、GFAP引物（上海生物生工有限公司合成）、G6850型電針治療儀（北京精工儀器廠）。

1.2 方法

1.2.1 動(dòng)物分組及模型建立 將60只大鼠分為正常組（NC組）、模型組（tMCAO組）、模型+電針治療組（EA組）、模型+電針+AQP4特異性拮抗劑TGN-02組（TGN-02組），每組15只。采用改良線栓法[10-11]規(guī)范化制備大鼠右側(cè)大腦中動(dòng)脈缺血/再灌注模型，缺血時(shí)間為90 min。TGN-02組大鼠于造模前腹腔注射AQP4特異性拮抗劑TGN-02，劑量為 200 mg/kg[12]。

1.2.2 電針刺激 EA組與TGN-02組參照中國(guó)針灸學(xué)會(huì)實(shí)驗(yàn)針灸委員會(huì)實(shí)驗(yàn)動(dòng)物穴位圖譜，選取大鼠“百會(huì)”穴及左側(cè)“四關(guān)”穴為電針穴位，電針頻率為2/20 Hz，波型為疏密波，強(qiáng)度以大鼠肢體輕微震顫為宜。EA組與TGN-02組首次電針刺激于再灌注后1 h進(jìn)行，刺激時(shí)間每次20 min，每天治療1次。

1.2.3 主要檢測(cè)指標(biāo)及方法

1.2.3.1 腦組織含水量檢測(cè) 再灌注后24 h，采用干濕法測(cè)定腦組織含水量。準(zhǔn)確稱取右側(cè)腦組織濕重，后置于100～110℃烤箱中烘干24 h以上至恒重，稱取腦干重。腦組織含水量百分比=（濕重-干重）/濕重×100%。

1.2.3.2 Western blotting檢測(cè)AQP4蛋白的表達(dá) 取大腦皮質(zhì)缺血區(qū)腦組織約50 mg入蛋白裂解液，充分勻漿后靜置半小時(shí)，4℃12 000 r/min離心15 min，取上清液。BCA蛋白定量法檢測(cè)上清液濃度。用4×上樣緩沖液將蛋白稀釋成相同濃度，-80℃保存。以50μg樣品行十二烷基硫酸鈉聚丙烯酰胺凝膠電泳（SDSPAGE）電泳，然后轉(zhuǎn)至PVDF膜上，5%脫脂奶粉封閉60 min，孵育 AQP4一抗（稀釋比例為 1∶2 000），4℃過夜，孵育二抗（稀釋比例為1∶5 000）1 h，ECL凝膠成像儀顯影，采用軟件Fusion進(jìn)行灰度值分析。

1.2.3.3 實(shí)時(shí)定量聚合酶鏈反應(yīng)（RT-qPCR）檢測(cè)AQP4、GFAP mRNA的表達(dá) 按Takara說明書提取大鼠大腦缺血區(qū)皮質(zhì)總RNA，后將總RNA逆轉(zhuǎn)錄為20μL cDNA。AQP4 mRNA 的上游引物 5′-AGATCAGCATCGCCAAGTCTCT-3′，下游引物為 5′-AGTGAGGTTCCAT-3′；GFAP mRNA 的上游引物 5′-AGTGGTATCGGTCCAAGTTTG-3′，下游引物為 5′-GTTGGCGATAAGTCATTAC-3′；β-actin mRNA 的上游引物 5′-ACGGTCAGGTACTCACTATCG-3′，下游引物為 5′-GGCATAGAGGTCTTTACGGATG-3′。

1.2.3.4 免疫熒光檢測(cè)GFAP的表達(dá) 將冰凍切片采用0.5%聚乙二醇辛基苯基醚（Triton-X100）室溫孵育30 min，5%山羊血清 37℃封閉1 min，加GFAP一抗（稀釋比例 1∶100），4℃過夜，第 2天 37℃復(fù)溫 1 h，熒光二抗 37 ℃孵育 60 min，4，6-二脒基-2-苯基吲哚（DAPI）37℃孵育10 min，50%甘油封片。

1.3 統(tǒng)計(jì)學(xué)處理 應(yīng)用SPSS19.0統(tǒng)計(jì)軟件進(jìn)行數(shù)據(jù)處理，所有數(shù)據(jù)以±s表示，采用One-Way ANOVA分析，多組間進(jìn)一步比較采用LSD檢驗(yàn)。檢驗(yàn)水準(zhǔn)α=0.05，P＜0.05為差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。

2 結(jié) 果

2.1 各組大鼠腦水腫情況比較 再灌注后24 h，tMCAO組大鼠出現(xiàn)明顯腦水腫，EA組腦水腫較tMCAO組明顯減輕，TGN-02組腦水腫較EA組明顯加重，差異均有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P＜0.05）。見圖1。

圖1 各組腦水腫情況比較

2.2 各組大鼠大腦缺血皮質(zhì)區(qū)AQP4蛋白及mRNA表達(dá)情況 Western blotting結(jié)果顯示，NC組有少量AQP4蛋白表達(dá)。tMCAO組和EA組AQP4蛋白表達(dá)均高于NC組，EA組AQP4表達(dá)明顯低于tMCAO組，TGN-02組AQP4表達(dá)明顯低于EA組，差異均有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P＜0.05）。RT-qPCR 結(jié)果顯示，AQP4 mRNA 表達(dá)規(guī)律與蛋白表達(dá)規(guī)律一致，NC組表達(dá)很弱，EA組較tMCAO 組明顯減少（P＜0.05），TGN-02處理后，AQP4 mRNA 水平進(jìn)一步降低（P＜0.05）。見圖2、3。

圖2 各組SDS-PAGE電泳圖

圖3 各組AQP4蛋白及mRNA表達(dá)情況比較

2.3 各組大鼠大腦缺血皮質(zhì)區(qū)GFAP mRNA表達(dá)情況 RT-qPCR結(jié)果顯示，tMCAO組GFAP mRNA表達(dá)較NC組明顯升高，EA組較tMCAO組明顯減少，差異均有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P＜0.05）；阻斷APQ4作用后，電針治療未能下調(diào) GFAP mRNA表達(dá)（P＜0.01）。見圖4。

圖4 各組GFAP mRNA表達(dá)情況比較

2.4 各組大鼠大腦缺血皮質(zhì)區(qū)GFAP標(biāo)記的星形膠質(zhì)細(xì)胞比較 熒光共聚焦結(jié)果顯示，NC組星形膠質(zhì)細(xì)胞突起細(xì)長(zhǎng)，分支較少，tMCAO組星形膠質(zhì)細(xì)胞胞體肥大、腫脹、突起增多。EA組星形膠質(zhì)細(xì)胞數(shù)量較tMCAO組明顯減少。TGN-02作用被阻斷后，電針治療未能削弱星形膠質(zhì)細(xì)胞活化。見圖5。

圖5 各組GFAP陽(yáng)性星形膠質(zhì)細(xì)胞活化情況（400×）

3 討 論

在中樞神經(jīng)系統(tǒng)中表達(dá)的幾個(gè)水通道中，AQP4被認(rèn)為是治療腦腫瘤、創(chuàng)傷性腦損傷、腦積水和神經(jīng)炎癥等腦部疾病的一個(gè)很有治療前景的靶點(diǎn)[13-16]。AQP4不僅是腦內(nèi)一種特異性的水轉(zhuǎn)運(yùn)孔道，還參與維持腦內(nèi)微環(huán)境、調(diào)節(jié)神經(jīng)傳導(dǎo)、誘導(dǎo)神經(jīng)再生和自身免疫的應(yīng)答等病理生理反應(yīng)。

腦內(nèi)與毛細(xì)血管、蛛網(wǎng)膜和軟腦膜直接接觸的星形膠質(zhì)細(xì)胞所組成的膠質(zhì)界膜的致密星形足突是AQP4的主要表達(dá)區(qū)域[17-18]。血管周圍的星形細(xì)胞足突是AQP4高表達(dá)的區(qū)域[19-20]。研究表明，AQP4參與了星形膠質(zhì)細(xì)胞調(diào)節(jié)腦、血管和腦室之間水的交換及腦缺血發(fā)生后星形膠質(zhì)細(xì)胞的激活。MANLEY等[21]發(fā)現(xiàn)，AQP4基因敲除小鼠較野生型小鼠行tMCAO術(shù)后存活率高，且AQP4基因敲除的小鼠星形膠質(zhì)細(xì)胞周圍毛細(xì)血管腫脹程度及腦水腫與野生型小鼠相比明顯減輕。THRANE等[22]研究顯示，AQP4的缺失可減弱星形膠質(zhì)細(xì)胞鈣離子信號(hào)，從而減弱AQP4表達(dá)增高誘導(dǎo)的星形膠質(zhì)細(xì)胞腫脹、活化。AQP4基因敲除小鼠的星形膠質(zhì)細(xì)胞的增殖、再激活和膠質(zhì)瘢痕形成受到明顯抑制[8]，過表達(dá)AQP4可促進(jìn)細(xì)胞黏附、新的屏障和膠質(zhì)界膜形成[9]。

研究表明，電針治療可下調(diào)腦缺血/再灌注損傷后腦內(nèi)AQP4表達(dá)。任清瀟等[23]發(fā)現(xiàn)，再灌注后24 h，電針可下調(diào)因腦缺血而誘導(dǎo)的AQP4表達(dá)升高，且血管周邊AQP4分布減少。有研究表明，電針治療能明顯減輕血-腦屏障的破壞，減輕腦水腫，減少IgG外滲，降低AQP4和金屬蛋白酶-9（MMP-9）的表達(dá)，且AQP4和MMP-9的變化有顯著相關(guān)性，推測(cè)電針對(duì)腦再灌注后血-腦屏障損傷的保護(hù)作用可能與其調(diào)節(jié)AQP4表達(dá)有關(guān)[24-25]。陳春芳等[26]也有相同的發(fā)現(xiàn)。盡管大量研究表明，電針治療可下調(diào)AQP4表達(dá)，減輕腦水腫，但電針治療減輕腦水腫的機(jī)制是否與下調(diào)AQP4相關(guān)？還是這僅是一種腦缺血后的伴隨現(xiàn)象？在目前的研究中尚無定論，基于此，本研究采用腹腔注射TGN-02特異性阻斷AQP4表達(dá)，觀察電針治療后腦水腫情況是否同單純電針治療組一樣得到改善。結(jié)果表明，AQP4作用被阻斷后，電針治療減輕腦水腫的作用明顯減弱，從而證實(shí)了電針確實(shí)可以通過調(diào)節(jié)AQP4表達(dá)，減輕腦水腫。在證實(shí)電針可以通過下調(diào)AQP4表達(dá)減輕腦水腫損傷后，本課題進(jìn)一步探討，該作用是否與減輕星形膠質(zhì)細(xì)胞的活化有關(guān)，結(jié)果發(fā)現(xiàn)，當(dāng)阻斷AQP4作用后，電針治療并不能明顯削弱星形膠質(zhì)細(xì)胞的活化，表明了電針治療減輕腦缺血誘導(dǎo)的星形膠質(zhì)細(xì)胞的活化與其下調(diào)AQP4有關(guān)。

本研究從電針減輕腦缺血/再灌注后腦水腫為切入點(diǎn)，特色之處在于采用腹腔注射AQP4抑制劑，觀察腦水腫改善情況，并同時(shí)檢測(cè)腦內(nèi)星形膠質(zhì)細(xì)胞的活化情況。研究結(jié)果表明，電針可通過下調(diào)AQP4表達(dá)，減輕腦水腫和腦缺血誘導(dǎo)的星形膠質(zhì)細(xì)胞的活化，為電針在臨床上治療腦梗死提供了進(jìn)一步的理論依據(jù)。

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