熊流新 ，黃 健 ，2，張 濤 ，李曉婷 ，徐 梅 ，陳昱希 ，陳安林 ，2，胡永林 ，2，閔 迅 ，2△（.遵義醫(yī)學(xué)院檢驗(yàn)醫(yī)學(xué)院，貴州遵義563099；2.遵義醫(yī)學(xué)院附屬醫(yī)院醫(yī)學(xué)檢驗(yàn)科，貴州遵義563003）

布魯氏菌病是由布魯氏菌引起的人畜共患疾病。該病在臨床上以長(zhǎng)期發(fā)熱、多汗、關(guān)節(jié)損害、淋巴和肝、脾大為主要癥狀，其病程進(jìn)入慢性期則可能導(dǎo)致多器官不可逆損害[1]。據(jù)WHO統(tǒng)計(jì)，全球每年有超過(guò)50萬(wàn)新發(fā)病例[2]。近年來(lái)，該病發(fā)病例數(shù)及流行范圍不斷擴(kuò)大，為世界公認(rèn)危害公共衛(wèi)生安全最大的傳染病之一[3]。臨床上主要以多西環(huán)素聯(lián)合利福平或鏈霉素治療為主[4]。近年來(lái)，對(duì)利福平耐藥布魯氏菌的相關(guān)報(bào)道正逐年增多，這給該病積極、有效的治療帶來(lái)嚴(yán)峻挑戰(zhàn)[5]。因此，布魯氏菌疫苗的相關(guān)研究正成為一種積極、有效的預(yù)防手段。

目前，布魯氏菌活疫苗主要分為2類(lèi)，一類(lèi)是減毒光滑型疫苗，主要包括羊種布魯氏菌Rev.1疫苗株、牛種布魯氏菌S19疫苗株、豬種布魯氏菌S2疫苗株，其含有的脂多糖（LPS）成分能刺激免疫細(xì)胞產(chǎn)生良好的保護(hù)作用[6]。但該類(lèi)疫苗往往由于LPS O-側(cè)鏈能刺激產(chǎn)生非特異性抗體，導(dǎo)致臨床無(wú)法鑒別免疫接種與野生株感染。此外，其還存在較嚴(yán)重的毒力返祖現(xiàn)象，以致動(dòng)物流產(chǎn)及播散性感染等情況的發(fā)生[7]。另一類(lèi)是減毒粗糙型疫苗，主要包括牛種布魯氏菌R型45/20和RB51。其通過(guò)反復(fù)傳代減毒獲得，由于該疫苗本身不含LPS O-側(cè)鏈，所以不會(huì)干擾常規(guī)血清學(xué)檢查[8]。但其也存在免疫保護(hù)效果差，疫苗菌株不穩(wěn)定從而出現(xiàn)粗糙型菌株轉(zhuǎn)變?yōu)楣饣途?，并恢?fù)強(qiáng)毒性等現(xiàn)象[9]。因此，研發(fā)免疫原性強(qiáng)、安全性好、價(jià)格低廉的布魯氏菌蛋白質(zhì)疫苗正成為當(dāng)前的研究熱點(diǎn)。

蛋白質(zhì)疫苗具有免疫原性高、保守性好、能覆蓋絕大多數(shù)血清型及生產(chǎn)成本低廉等諸多優(yōu)點(diǎn)[10]。TABYNOV等[11]研究證實(shí)，將布魯氏菌外膜蛋白Omp19制成的蛋白質(zhì)疫苗誘導(dǎo)小鼠刺激CD4+T和CD8+T細(xì)胞產(chǎn)生干擾素γ（INF-γ），并且攻毒保護(hù)力能夠達(dá)到牛布魯氏菌S19疫苗株的水平。KIM等[12]研究BCSP31（布魯氏菌31 000的外膜蛋白）、Omp3b和Cu-Zn SOD（銅-鋅超氧化物歧化酶）作為蛋白質(zhì)疫苗能引起強(qiáng)烈的Th1型免疫反應(yīng)，顯著提高IFN-γ及腫瘤壞死因子α（TNF-α）分泌水平，激活巨噬細(xì)胞參與的細(xì)胞免疫。這些蛋白質(zhì)在所構(gòu)建的動(dòng)物模型中均具有不同程度的保護(hù)效應(yīng)。Omp16是布魯氏菌重要的毒力因子。研究證實(shí)，布魯氏菌在敲除Omp16后，影響了外膜肽聚糖的連接，致使布魯氏菌外膜結(jié)構(gòu)受到破壞，最終細(xì)胞外膜通透性增加而導(dǎo)致細(xì)胞溶解死亡，這表明了Omp16是布魯氏菌存活必不可少的外膜蛋白[13]。文獻(xiàn)報(bào)道Omp16在進(jìn)入小鼠體內(nèi)時(shí)激活Toll樣受體4（TLR4），引起TLR4自身二聚化與髓樣細(xì)胞分化蛋白MyD88結(jié)合，MyD88與白細(xì)胞介素-1（IL-1）相關(guān)激酶（IRAK）結(jié)合導(dǎo)致IRAK自身磷酸化，激活腫瘤相關(guān)因子6（TRAF-6），使有絲分裂酶原蛋白激酶（MAPK）活化，一方面刺激依賴MAPK途徑的巨噬細(xì)胞，增強(qiáng)其吞噬活性，使TNF-α等細(xì)胞因子上調(diào)，另一方面通過(guò)核轉(zhuǎn)錄因子-κB（NF-κB）激活 I-κB 家族的α、β激酶，導(dǎo)致I-κB磷酸化降解，最后NF-κB轉(zhuǎn)到細(xì)胞核啟動(dòng) IL-1、IL-6、TNF-α 轉(zhuǎn)錄[14]。外膜蛋白Omp16在TLR4-MyD88信息轉(zhuǎn)導(dǎo)通路上突出的功能使其有望成為布魯氏菌蛋白疫苗研發(fā)的一個(gè)重要靶點(diǎn)。

迄今為止，尚鮮見(jiàn)布魯氏菌外膜蛋白Omp16重組蛋白疫苗保護(hù)效應(yīng)的相關(guān)研究。因此，本課題擬通過(guò)生物信息學(xué)分析、基因克隆、蛋白質(zhì)表達(dá)及純化技術(shù)，以及多克隆抗體制備等，以期為后續(xù)的Omp16蛋白質(zhì)疫苗的研發(fā)提供實(shí)驗(yàn)基礎(chǔ)。

1 材料與方法

1.1 材料

1.1.1 菌株與質(zhì)粒 大腸桿菌E.coliBL21（DE3）、pET28a（+）質(zhì)粒、E.coliDH5a 為本課題組保存；布魯氏菌標(biāo)準(zhǔn)菌株（Brucella melitensis ATCC 23456）為遵義醫(yī)學(xué)院附屬醫(yī)院醫(yī)學(xué)檢驗(yàn)科惠贈(zèng)。

1.1.2 實(shí)驗(yàn)動(dòng)物 BALB/c小鼠，SPF級(jí)，7周，雌性，購(gòu)自中國(guó)人民解放軍第三軍醫(yī)大學(xué)動(dòng)物實(shí)驗(yàn)室中心。所有動(dòng)物的處理按照遵義醫(yī)學(xué)院倫理委員會(huì)行為準(zhǔn)則進(jìn)行。

1.1.3 主要試劑 營(yíng)養(yǎng)瓊脂粉、丙烯酰胺、考馬斯亮藍(lán)R-250、咪唑、雙丙烯酰胺、Tris堿、酵母提取物、氯化鈉、十二烷基硫酸鈉（SDS）、N，N，N′，N′-四甲基乙二胺、胰蛋白胨、溴酚藍(lán)購(gòu)于生工生物工程（上海）股份有限公司；甘氨酸、β-巰基乙醇、過(guò)硫酸銨、異丙基硫代-β-D-半乳糖苷（IPTG）、1.0 mol/L Tris-HCl（pH6.8）、1.5 mol/L Tris-HCl（pH8.8）、GoldView核酸染料、50×TAE Buffer、5%胎牛血清、HRP-羊抗鼠IgG 0.01 mol/L、磷酸鹽緩沖液（PBS）粉劑 3，3′，5，5′-四甲基聯(lián)苯胺（TMB）底物顯色液、超敏電化學(xué)發(fā)光試劑盒、脫脂奶粉、PVDF膜、脫脂奶粉購(gòu)于北京索萊寶公司；彩虹蛋白質(zhì)Marker、DNA聚合酶（Primer Star高保真）、T4DNA連接酶、DNA Marker（DL2000、DL5000）、限制性內(nèi)切酶 BamH Ⅰ/XhoⅠ購(gòu)于日本TAKARA公司；基因組DNA抽提試劑盒、小量質(zhì)粒DNA提取試劑盒、DNA純化試劑盒購(gòu)于北京天根公司；血平板培養(yǎng)基購(gòu)于鄭州安圖綠科生物工程有限公司；96孔ELISA板購(gòu)于美國(guó)康寧公司；鋁佐劑（Inject Alum NO.77161）購(gòu)于美國(guó)Pierce公司。

1.2 方法

1.2.1 Omp16蛋白生物學(xué)信息分析 利用隱馬爾科夫模型和神經(jīng)網(wǎng)絡(luò)方法進(jìn)行目的蛋白序列保守性預(yù)測(cè)（http：//blast.ncbi.nlm.nih.gov/）、跨膜結(jié)構(gòu)預(yù)測(cè)（http：//www.cbs.dtu.dk/）、信號(hào)肽預(yù)測(cè)（http：//www.cbs.dtu.dk/）。1.2.2 引物設(shè)計(jì) 根據(jù)GenBank中布魯氏菌的基因序列（NC_009505.1），使用 PrimerPremier 5.0設(shè)計(jì) 2種不同序列的Omp16基因引物。Omp-16-1F：CGCGGATCCATGCGCCGTATCCAGTCGATTG，Omp-16-1R：CCGCTCGAGTTACCGTCCGGCCCCGTTGA，Omp-16-2F：CGCGGATCCATGAAGAAGAACCTTCCG，Omp-16-2R：CCGCTCGAGCCGTCCGGCCCCGTTGA，標(biāo)有下劃線為限制性內(nèi)切酶的酶切位點(diǎn)。本實(shí)驗(yàn)引物由生工生物工程（上海）股份有限公司合成。

1.2.3 PCR擴(kuò)增目的基因 以細(xì)菌DNA為模板，擴(kuò)增條件如下。Omp16-1：98℃變性 20 s，55℃退火 15 s，72℃延伸 45 s，30個(gè)循環(huán)，72℃延伸 5 min。Omp16-2：98℃ 變性 20 s，55℃退火 15 s，72℃延伸 42 s，30個(gè)循環(huán)，72℃延伸5 min；4℃保存。取10μL進(jìn)行1%瓊脂糖電泳，PCR產(chǎn)物經(jīng)DNA回收試劑盒回收，-20℃保存。

1.2.4 構(gòu)建2種不同序列布魯氏菌Omp16的重組質(zhì)粒 用限制性內(nèi)切酶BamHⅠ和XholⅠ同時(shí)雙酶切目的基因和質(zhì)粒，使用DNA純化試劑盒回收。將目的基因和質(zhì)粒按比例混合，使用T4連接酶在PCR儀中16℃連接16 h，連接產(chǎn)物轉(zhuǎn)入感受態(tài)細(xì)胞DH5a中，用含卡那霉素（100μg/mL）的LK平板篩選陽(yáng)性克隆菌，使用質(zhì)粒提取試劑盒提取質(zhì)粒后，行雙酶切鑒定及送生工生物工程（上海）股份有限公司測(cè)序鑒定。

1.2.5 蛋白誘導(dǎo)表達(dá)及純化 將重組質(zhì)粒轉(zhuǎn)入E.coliBL21（DE3）中，在含有卡那霉素（100 μg/mL）的 LK 平板上，37℃培養(yǎng)過(guò)夜，挑取克隆陽(yáng)性菌落轉(zhuǎn)于10 mL含有卡那霉素（1∶1 000）的 LB 培養(yǎng)液中，37℃，200 r/min搖菌過(guò)夜。次日按1∶50轉(zhuǎn)種含有卡那霉素（1∶1 000）的LB培養(yǎng)液中，將菌液搖至600 nm波長(zhǎng)下光密度（OD）600nm值為 0.5時(shí)加入IPTG 1 mmol/L，28℃、160 r/min誘導(dǎo)過(guò)夜后收菌。將其用1×Binding Buffer重懸后在冰上超聲破菌，將破菌后的上清液轉(zhuǎn)入鎳柱親和層析柱（Ni-NTA）中，經(jīng)咪唑緩沖液（20、30、40 mmol/L 咪唑，pH8.5，10 mmol/L PBS，300 mmol/L NaCl）充分洗脫后，用洗脫液（500 mmol/L 咪唑，pH8.5，10 mmol/L PBS，300 mmol/L NaCl）洗脫目的蛋白。行SDS聚丙烯酰胺凝膠電泳（SDS-PAGE）檢測(cè)蛋白的純度，用PBS超濾除去咪唑和NaCl，使用BCA蛋白定量試劑盒測(cè)定蛋白濃度。

1.2.6 多克隆抗體制備及其效價(jià)的檢測(cè) 將7周齡雌性BALB/c小鼠24只，按照隨機(jī)分配原則設(shè)立實(shí)驗(yàn)組和空白對(duì)照組。每組免疫6只小鼠，空白對(duì)照組僅注射佐劑，實(shí)驗(yàn)組注射佐劑與重組蛋白按1∶1混合的蛋白懸液。免疫劑量10μg/只（首次劑量加倍），免疫途徑為經(jīng)皮下多點(diǎn)注射，每次間隔2周，共免疫3次。末次免疫后第7天，經(jīng)尾靜脈采集血液，分離血清放4℃冰箱備用。采用間接ELISA法檢測(cè)血清抗體效價(jià)：抗原包被，將目的蛋白用碳酸鹽緩沖液稀釋至100μg/mL，將稀釋后的樣品加到96孔板中，每孔100μL，4℃過(guò)夜。每孔加入牛血清白蛋白（BSA）5%封閉2 h。用空白對(duì)照組小鼠血清作陰性對(duì)照。干燥清潔條件下將BALB/c小鼠斷尾采血清，將1μL小鼠血清加進(jìn)封閉液100μL，按比例稀釋至1×109，37℃孵育1 h。用專(zhuān)門(mén)PBS洗滌液洗板并吸干水。每孔加入100μL HRP標(biāo)記的羊抗鼠IgG（1∶5 000稀釋?zhuān)?7℃孵育1 h。洗板吸干水后加入100μL TMB顯色終止液顯色30 min，上酶標(biāo)儀前加入100μL顯色終止液。將酶標(biāo)儀波長(zhǎng)設(shè)置為450 nm，檢測(cè)OD值。以待測(cè)標(biāo)本OD450nm（P）/Alum 佐劑（N）≥2.1 結(jié)果判斷為陽(yáng)性結(jié)果。

1.2.7 Western blotting檢測(cè)Omp16蛋白的表達(dá) 取20μL2種不同序列的布魯氏菌Omp16蛋白，分別加入5μL的5×SDS-PAGE上樣緩沖液煮沸10 min，10 000 r/min、5 min后取5μL進(jìn)行SDS-PAGE電泳。電泳后轉(zhuǎn)PVDF膜，使用5%脫脂奶粉封閉2 h，用小鼠血清（1∶1 000）作為一抗4℃孵育16 h；PBST洗滌3次，加入HRP羊抗鼠 IgG（1∶5 000）作為二抗，37℃孵育 1 h，PBST 洗滌3次后使用超敏電化學(xué)發(fā)光試劑盒檢測(cè)結(jié)果。

2 結(jié) 果

2.1 Omp16蛋白保守結(jié)構(gòu)域預(yù)測(cè) Omp16蛋白分子保守性較高，在61-163aa處含有1個(gè)保守結(jié)構(gòu)域，命名為OmpA-C-like超家族，見(jiàn)圖1。

圖1 Omp16蛋白的保守性預(yù)測(cè)結(jié)果

2.2 Omp16蛋白跨膜結(jié)構(gòu)預(yù)測(cè) Omp16蛋白在氨基端6-28aa處可能有1個(gè)跨膜結(jié)構(gòu)，見(jiàn)圖2。

圖2 Omp16蛋白跨膜結(jié)構(gòu)預(yù)測(cè)結(jié)果

2.3 Omp16蛋白信號(hào)肽預(yù)測(cè) Omp16蛋白在氨基端1-24 aa處有 1個(gè)信號(hào)肽（Y=0.570），見(jiàn)圖3。

圖3 Omp16蛋白信號(hào)肽預(yù)測(cè)結(jié)果

2.4 Omp16基因的擴(kuò)增 根據(jù)以上生物信息學(xué)分析，本研究擬擴(kuò)增全長(zhǎng)及截短的Omp16基因序列Omp16-1（1-504）、Omp16-2（82-504），擴(kuò)增產(chǎn)物經(jīng)瓊脂糖電泳分析顯示，分別于504、423 bp處可見(jiàn)清晰的特異性條帶，大小與預(yù)期相符（圖4A），將 pET28a（+）-Omp16-1、pET28a（+）-Omp16-2重組質(zhì)粒雙酶切，經(jīng)1%瓊脂糖凝膠電泳，可見(jiàn)酶切產(chǎn)物與目的基因大小相符的酶切片段（圖4B）。構(gòu)建的質(zhì)粒經(jīng)生工生物工程（上海）股份有限公司分析，結(jié)果與預(yù)期一致，提示重組質(zhì)粒構(gòu)建成功（圖5）。

圖4 全長(zhǎng)及截短表達(dá)的Omp16基因PCR擴(kuò)增與重組質(zhì)粒雙酶切鑒定

圖5 重組質(zhì)粒測(cè)序峰圖

2.5 重組蛋白的誘導(dǎo)表達(dá)及純化 全長(zhǎng)及截短表達(dá)的Omp16經(jīng) IPTG誘導(dǎo)后，在相對(duì)分子質(zhì)量19.2×103、16.5×103處可見(jiàn)特異性蛋白條帶，大小與預(yù)期相符（圖6），經(jīng)Ni-NTA純化后可獲得高純度的目的蛋白。

2.6 多克隆抗體的制備和抗體效價(jià)檢測(cè) 將全長(zhǎng)及截短表達(dá)的Omp16重組蛋白免疫BALB/c小鼠制備多克隆抗體，采用間接ELISA法檢測(cè)血清IgG效價(jià)。實(shí)驗(yàn)結(jié)果顯示佐劑對(duì)照組幾乎不產(chǎn)生Omp16抗體，實(shí)驗(yàn)組全長(zhǎng)及截短表達(dá)的Omp16重組蛋白的血清IgG效價(jià)高達(dá)1×107，提示Omp16重組蛋白能刺激小鼠產(chǎn)生較強(qiáng)的免疫應(yīng)答（圖7），Omp16-1、Omp16-2均能刺激小鼠產(chǎn)生高滴度的多克隆抗體（均P＜0.05），且2組間抗體滴度比較無(wú)顯著變化（均P＞0.05）。

圖6 全長(zhǎng)及截短表達(dá)的Omp16重組蛋白純化的SDS-PAGE圖

圖7 小鼠皮下免疫后血清IgG抗體效價(jià)檢測(cè)

2.7 重組蛋白Western blotting鑒定 將純化的全長(zhǎng)及截短表達(dá)的布魯氏菌Omp16重組蛋白作為抗原，小鼠抗血清作為一抗，通過(guò)Western blotting進(jìn)行鑒定（圖8）。結(jié)果提示2種Omp16重組蛋白均能與小鼠血清中的抗體特異性結(jié)合。

圖8 重組蛋白Omp16的Western blotting鑒定

3 討 論

蛋白質(zhì)疫苗具有免疫效果好且安全性高的特點(diǎn)，新的保護(hù)性抗原的篩選對(duì)提高其免疫保護(hù)效果具有十分重要的意義。MALLICK等[15]研究發(fā)現(xiàn)，布魯氏菌核糖體蛋白L7/L12在未經(jīng)脂化處理時(shí)無(wú)法引起免疫保護(hù)反應(yīng)，但經(jīng)過(guò)脂化處理后能引起強(qiáng)烈的體液免疫和細(xì)胞免疫反應(yīng)，產(chǎn)生高滴度的IgG2a，攻毒保護(hù)效果明顯增加。Omp16是布魯氏菌重要的毒力因子，屬于脂蛋白[16]。Omp16在TLR4-MyD88信息轉(zhuǎn)導(dǎo)通路上突出的功能，使其有望成為布魯氏菌蛋白疫苗的一個(gè)重要抗原靶點(diǎn)。

本課題采用的原核表達(dá)是最常用的表達(dá)系統(tǒng)，是應(yīng)用最早、最廣泛的系統(tǒng)，簡(jiǎn)便快捷、成本低廉。但原核表達(dá)系統(tǒng)存在2個(gè)關(guān)鍵的問(wèn)題：（1）異源表達(dá)的蛋白與大腸埃希菌系統(tǒng)不相容，蛋白無(wú)法表達(dá)；（2）表達(dá)的蛋白不可溶。影響因素包括蛋白自身的因素、載體選擇、誘導(dǎo)劑的量、誘導(dǎo)時(shí)間、誘導(dǎo)溫度等[17]。本課題組先后嘗試了不同的載體，如pE-SUMO載體、pCold I載體等，但其表達(dá)產(chǎn)物均為包涵體形式。實(shí)驗(yàn)最終選用pET28a（+）載體，pET系統(tǒng)是目前E.coli克隆表達(dá)重組蛋白最強(qiáng)大的系統(tǒng)，當(dāng)目的基因克隆到質(zhì)粒時(shí)，受噬菌體T7強(qiáng)轉(zhuǎn)錄和可選擇的翻譯信號(hào)控制，T7 RNA酶十分高效，短時(shí)間內(nèi)可使目的蛋白產(chǎn)量達(dá)到細(xì)菌總蛋白50%以上。本實(shí)驗(yàn)選用大腸埃希菌表達(dá)系統(tǒng)E.coliBL21（DE3），因其遺傳背景清楚，能高效表達(dá)具有生物學(xué)活性的蛋白分子[18]，在實(shí)驗(yàn)過(guò)程中發(fā)現(xiàn)，Omp16-1蛋白可溶性的表達(dá)量較低，且主要以包涵體形式出現(xiàn)，為了獲得重組蛋白Omp16的大量可溶性表達(dá)，本研究對(duì)Omp16蛋白全長(zhǎng)進(jìn)行生物學(xué)信息分析，發(fā)現(xiàn)這可能與其在N端1-24 aa處有1個(gè)信號(hào)肽（Y=0.570），且N端6-28 aa的位置存在1個(gè)跨膜結(jié)構(gòu)密切相關(guān)。本研究通過(guò)生物學(xué)信息綜合分析，成功構(gòu)建了 pET28a（+）-Omp16-2 的截短表達(dá)質(zhì)粒，轉(zhuǎn)入E.coliBL21（DE3），經(jīng)IPTG誘導(dǎo)后獲得了大量高純度、可溶性的目的蛋白Omp16-2，也從側(cè)面證實(shí)了上述預(yù)測(cè)的正確性。

本研究采用全長(zhǎng)及截短表達(dá)的重組蛋白Omp16，通過(guò)皮下多點(diǎn)注射的方法免疫BALB/c小鼠，結(jié)果證實(shí)Omp16-1、Omp16-2均能刺激小鼠產(chǎn)生高滴度的多克隆抗體（均P＜0.05），且2組間抗體滴度比較無(wú)顯著變化（均P＞0.05）。Western blotting實(shí)驗(yàn)證實(shí) 2種 Omp16重組蛋白均能與小鼠血清中的抗體特異性結(jié)合。因此，推測(cè)Omp16的抗原表位可能位于OmpA-C-like超家族結(jié)構(gòu)域。后續(xù)研究將依托制備的高純度、高含量的重組蛋白Omp16-2，擬通過(guò)構(gòu)建布魯氏菌的黏膜或食道感染模型，通過(guò)系列主動(dòng)免疫、被動(dòng)保護(hù)等體內(nèi)外實(shí)驗(yàn)，進(jìn)一步驗(yàn)證重組蛋白Omp16在布魯氏菌感染方面的保護(hù)效應(yīng)。

[1]ROSSETTI CA，ARENAS-GAMBOA AM，MAURIZIO E，et al.Caprine brucellosis：a historically neglecteddis ease with significant impact on public health[J].PLoS Negl Trop Dis，2017，11（8）：e0005692.

[2]JIA B，ZHANG F，LU Y，et al.The clinical features of 590 patients with brucellosis in Xinjiang，China with the emphasis on the treatment of complications[J].PLoS Negl Trop Dis，2017，11（5）：e0005577.

[3]XAVIER MN，WINTER MG，SPEES AM，et al.CD4+T cell-derived IL-10 promotes Brucella abortus persistence via modulation of macrophage function[J].PLoS Pathog，2013，9（6）：e1003454.

[4]FERNáNDEZ AG，F(xiàn)ERRERO MC，HIELPOS MS，et al.Baldi PC.proinflammatory response of human trophoblastic cells to brucell-a abortus infection and upon interactions with infected phagocytes[J].Biol Reprod，2016，94（2）：48.

[5]ISMAYILOVA R，MODY R，ABDULLAYEV R，et al.Screening of household family membersofbrucellosis cases and neighboring community members in Azerbaijan[J].Am J Trop Med Hyg，2013，88（5）：929-931.

[6]SHELL WS，SAYED ML，SAMY AA，et al.Using real-time polymerase chain reaction as an alternative rapid method for enumeration of colony count in live Brucella vaccines[J].Vet World，2017，10（6）：610-615.

[7]DE Y，DONG C，CAO Y，et al.Genome-wide sequence transposon insertion sites andanalyze the essential genes of Brucella melitensis[J].Microb Pathog，2017，112：97-102.

[8]ZHANG J，YIN S，YI D，et al.The Brucella melitensis M5-90ΔmanB live vaccine candidate is safer than M5-90 and confers protection against wild-type challenge in BALB/c mice[J].Microb Pathog，2017，112：148-155.

[9]LALSIAMTHARA J，LEE JH.Development and trial of vaccines against Brucella[J].J Vet Sci，2017，18（1）：281-290.

[10]MENZIES PI.Vaccination programs for reproductive disorders of small ruminants[J].Anim Reprod Sci，2012，130（3/4）：162-172.

[11]TABYNOV K，YESPEMBETOV B，MATIKHAN N，et al.First evaluation of an influenza viral vector based Brucella abortus vaccine in sheep and goats：assessment of safety，immunogen-icity and protective efficacy against Brucella melitensis infection[J].Vet Microbiol，2016，197：15-20.

[12]KIM WK，MOON JY，KIM S，et al.Comparison between immunization routes of live attenuated salmonella typhimurium strains expressing BCSP31，Omp3b，and SOD of Brucella abortus in murine model[J].Front Microbiol，2016，7：550.

[13]SIDHU-MU?OZ RS，SANCHO P，VIZCAíNO N，et al.Brucella ovis PA mutants for outer membrane proteins Omp10，Omp19，SP41，and BepC arenot altered in their virulence and outer membrane properties[J].Vet Microbiol，2016，186：59-66.

[14]GOMES MTR，CAMPOS PC，ALMEIDA LAD，et al.The role of innate immune signals in immunity to Brucella abortus[J].Frontiers in Cellular&Infection Microbiology，2012，2（10）：130.

[15]MALLICK AI，SINGHA H，KHAN S，et al.Escheriosome-mediated delivery of recombinant ribosomal L7/L12 protein confers protection against murine brucellosis[J].Vaccine，2007，25（46）：7873-7884.

[16]TIBOR A，DECELLE B，LETESSON JJ.Outer membrane proteins Omp10，Omp16，and Omp19 of Brucella spp.Are lipoproteins[J].Infect Immun，1999，67（9）：4960-4962.

[17]TERPE K.Overview of bacterial expression systems for heterologous protein production：from molecular and biochemical fundamentals to commercial systems[J].Appl Microbiol Biotechnol，2006，72（2）：211-222.

[18]MIROUX B，WALKER JE.Over-production of proteins in Escherichia coli：mutant hoststhat allowsynthesis of some membraneproteins and globular proteins at high levels[J].J Mol Biol，1996，260（3）：289-298.