楊燕燕，謝金東，俞春英，周建華，王訓(xùn)立

(福建中醫(yī)藥大學(xué)，福州350122)

動脈粥樣硬化(AS)是多數(shù)慢性心血管疾病的發(fā)病基礎(chǔ)，表現(xiàn)為動脈壁內(nèi)大量脂質(zhì)和纖維組織蓄積并伴有局部炎性反應(yīng)，嚴重危害著人類健康。AS發(fā)病機制先后出現(xiàn)如“脂質(zhì)浸潤”“中膜平滑肌細胞增殖”“內(nèi)皮損傷”“炎癥”和“血栓源”等各種假說[1,2]。近年來研究表明，非感染性甚至感染性因素引起的炎癥和免疫機制貫穿于AS的發(fā)生和發(fā)展過程中[3,4]。靈芝屬真菌，在我國傳統(tǒng)用藥中有悠久的歷史，常用于扶正固本，增強身體的抵抗能力。靈芝多糖(GLPs)具有抗腫瘤、保肝、免疫調(diào)節(jié)、抗氧化、抗病毒、提高耐缺氧能力等生物學(xué)活性[5]；還可以調(diào)節(jié)血脂溶度，保護血管內(nèi)皮細胞功能及抑制血小板凝集、抗血栓形成[6,7]。本研究2015年10月～2016年12月以ApoE-/-小鼠為模型，應(yīng)用不同劑量GLPs干預(yù)，探討GLPs對基因缺失AS模型小鼠血脂及血凝集素樣氧化低密度脂蛋白受體-1(LOX-1)、腫瘤壞死因子-α(TNF-α)、細胞間黏附分子-1(ICAM-1)等炎性因子的影響。

1 材料與方法

1.1 動物與分組 8～10周齡SPF級C57BL/6遺傳背景的ApoE-/-小鼠40只，隨機分為模型組、GLPs低劑量組(200 mg/kg)、GLPs中劑量組(500 mg/kg)、GLPs高劑量組(800 mg/kg)，每組10只；另取8～10周齡SPF級C57BL/6J小鼠10只，設(shè)為正常對照組。實驗期間分籠喂養(yǎng)，每籠5只，雌、雄各半。動物來源于北京維通利華實驗動物技術(shù)有限公司[許可證號SCXK(京)2012-0001]。小鼠普通顆粒詞料適應(yīng)性喂養(yǎng)1周后，正常組飼喂普通飼料，其余ApoE-/-小鼠給予高脂飼料，連續(xù)90 d。AS模型造模成功后，低劑量組、中劑量組、高劑量組分別給予GLPs 200 、500 、800 mg/kg每日灌胃給藥1次，正常組和模型組予以等量生理鹽水，治療期為30 d。

1.2 儀器及試劑 SK1261 DNA提取試劑盒；SK1312 Total RNA Extractor試劑盒； SK2445第一鏈cDNA合成試劑盒(AMV First Strand cDNA Synthesis Kit)；B639273 2X SG Fast qPCR Master Mix(High Rox)；Trizol提取試劑盒； TaqDNA聚合酶、瓊脂糖M、EB染料、10×PCR Buffer、25 mmol/L MgCl2、10 mmol/L dNTP、DNA Marker、6×DNA Loading Dye、Rnase,Dnase-free、10×TAE等；以上來源于生工生物工程(上海)股份有限公司。無水乙醇AR級購自國藥集團化學(xué)試劑有限公司；GLPs來源于杭州眾芝康菇生物科技有限公司；TNF-α抗體購自美國CST公司；ICAM-1、LOX-1抗體購自英國Abcam公司；β-Actin抗體購自Trans公司；Pierce Goat Anti-Mouse IgG(H+L)-HRP Antibody和Goat Anti-Rabbit IgG-HRP Antibody購自美國Thermo Fisher公司。眼科剪、止血鉗、刀片、滅菌棉簽、75%乙醇等；普通二級清潔飼料，高脂飼料(1%膽固醇、10%豬油、89%基礎(chǔ)飼料)。美國ABI 2720 PCR擴增儀；美國ABI Stepone plus型熒光定量PCR儀；美國Biorad Mini-PROTEAN@Tetra小型垂直電泳槽；美國Biorad Power Pac電泳儀；美國Biorad ChemiDoc XRS +凝膠成像分析系統(tǒng)；日本尼康P80數(shù)碼相機；美國OHAUS AR2140電子分析天平；日本三洋MLS-3750高壓滅菌器；青島海爾HYCD-205冷藏冷凍冰箱；海門其林貝爾VOREX-6漩渦混合器、LX-200手掌型離心機；上海精宏DK-8D水浴鍋、DHG-9053A電熱恒溫鼓風(fēng)干燥箱；北京六一DYY-6C電泳儀；上海安亭TGL-16G高速離心機；賽默飛世爾17R小型高速冷凍離心機；德國Eppendorf 10 L，200 L，1000 L移液器；日本日立7180全自動生化分析儀。

1.3 AS模型成功判定 高脂飼料喂養(yǎng)90 d，解剖取模型及正常組小鼠主動脈血管，預(yù)冷生理鹽水沖洗，立即用4%多聚甲醛溶液固定，24 h后更換75%乙醇溶液，常規(guī)程序脫水，石蠟包埋，連續(xù)5 μm切片后HE染色，切片貼于經(jīng)多聚賴氨酸處理的載玻片上，依次放入二甲苯Ⅰ和Ⅱ各脫蠟8 min；100%、90%、70%梯度乙醇各浸泡2 min，蒸餾水洗2 min；蘇木精染色8 min；自來水浸泡10 min，蒸餾水洗滌數(shù)秒鐘；伊紅復(fù)染2 min；70%和80%乙醇分別脫水20 s和30 s；二甲苯透明，中性膠封片，病理形態(tài)學(xué)觀察判定AS模型成功與否。

1.4 血清血脂檢測 GLPs每日灌胃給藥30 d，小鼠禁食12 h，摘眼球取血，3 000 r/min離心10 min分離血清。檢測血清中膽固醇(TC)、高密度脂蛋白膽固醇(HDL-C)、低密度脂蛋白膽固醇(LDL-C)和甘油三酯(TG)等生化指標的表達水平。

1.5 LOX-1、TNF-α及ICAM-1 mRNA表達檢測 取動脈組織進行實驗，采用實時熒光定量PCR法，Total RNA 5.0 L，0.2 g/ L Random Primer p(dN)6 1.0 L，Rnase-free ddH2O定容至13.0 L；混合稍離心5 s，70 ℃溫浴5 min；冰浴10 s后加入5×Reaction Buffer 4.0 L，10 mmol/L dNTP Mix 2.0 L，20 U/L Rnase inhibitor 1.0 L，10 U/L AMV Reverse Transcriptase 2.0 L；37 ℃、42 ℃、70 ℃依次溫浴5 min、60 min、10 min，終止反應(yīng)。溶液于-20 ℃凍存?zhèn)溆谩Ｒ镄蛄袇⒄誈ene Bank，由生工生物工程(上海)股份有限公司合成。PCR反應(yīng)總體系為2×SybrGreen qPCR Master Mix 10.0 L，Template cDNA 2.0 L，10 μmol/L PCR Forward Primer 0.4 L，10 μmol/L PCR Reverse Primer 0.4 L，ddH2O 7.2 L。反應(yīng)條件為95 ℃ 3 min；95 ℃ 7 s，55 ℃ 10 s，72 ℃ 15 s，共45個循環(huán)。以GAPDH為內(nèi)參，數(shù)據(jù)計算依據(jù)2-ΔΔCT法。

2 結(jié)果

2.1 正常組與模型組動脈病理組織學(xué)比較 正常組小鼠的主動脈壁層次清晰，內(nèi)膜連續(xù)，中膜平滑肌細胞排列整齊，未見AS斑塊形成。模型組小鼠組織病理切片顯示主動脈管壁厚薄不均，血管內(nèi)膜增厚，內(nèi)部脂質(zhì)池較大，管腔內(nèi)斑塊沉積，有泡沫細胞、炎癥細胞浸潤，表現(xiàn)典型的AS病理特征。見圖1。

圖1 正常組(A)與模型組(B)動脈病理組織學(xué) 比較(HE染色，×400)

2.2 各組血脂水平比較 與正常組相比時，模型組TC、TG、LDL-C水平顯著升高，而HDL-C顯著降低，均具有統(tǒng)計學(xué)意義(P均<0.05)。與模型組相比，GLPs低、中、高劑量組的TC、LDL-C及低劑量組TG水平降低，高劑量組HDL-C水平升高(P均<0.05)。GLPs不同劑量組間血脂水平差異無統(tǒng)計學(xué)意義(P>0.05)。見表1。

表1 各組小鼠血脂水平比較

2.3 各組LOX-1、TNF-α及ICAM-1 mRNA比較 與正常組相比，模型組LOX-1、TNF-α及ICAM-1 mRNA表達水平明顯升高(P均<0.05)。與模型組相比，GLPs低、中、高劑量組LOX-1、ICAM-1及GLPs低、高劑量組TNF-α mRNA表達均明顯降低(P均<0.05)。GLPs不同劑量組間LOX-1、TNF-α及ICAM-1 mRNA表達差異無統(tǒng)計學(xué)意義(P>0.05)。見表2。

表2 各組小鼠LOX-1、TNF-α及ICAM-1 mRNA 表達比較

3 討論

AS作為一種老年多發(fā)慢性疾病，近年來逐步呈現(xiàn)年輕化及上升趨勢，其基本病理過程一般分為脂質(zhì)條紋、粥樣斑塊及纖維斑塊三期。隨著炎癥因子及血流動力學(xué)改變，處于穩(wěn)定狀態(tài)的斑塊最后破裂為不穩(wěn)定易損斑塊。眾多發(fā)病因素當(dāng)中，血脂紊亂所致的高脂血癥是AS疾病的關(guān)鍵危險因素。而ApoE基因作為血漿脂蛋白的重要成分，能夠調(diào)控血漿中脂蛋白的脂解與清除，并調(diào)控極低密度脂蛋白和TG產(chǎn)量。因此，ApoE在AS的發(fā)生發(fā)展過程中起關(guān)鍵作用。1992年，Piedrahita等成功培育了C57BL/6背景的ApoE-/-小鼠。與野生型小鼠相比，由于ApoE基因的缺失，當(dāng)給予其高脂飲食時將導(dǎo)致富含膽固醇的脂蛋白清除障礙，血漿膽固醇水平升高，最終體內(nèi)蓄積脂蛋白，AS斑塊形成。ApoE-/-小鼠的AS病變斑塊形成過程同人類相似，且穩(wěn)定性好、重復(fù)性高，近年來已取代之前常用的兔、大鼠、豬等動物，成為研究AS發(fā)病機制及尋找藥物治療靶點等方面的主要模式動物[8,9]。本研究采用90 d的高脂飲食誘導(dǎo)ApoE-/-小鼠，血清TC、TG、LDL-C指標明顯升高，HDL-C明顯降低，且主動脈斑塊增多，主動脈管壁厚薄不均，內(nèi)部脂質(zhì)池較大，管腔內(nèi)泡沫細胞、炎癥細胞浸潤，表現(xiàn)典型AS病理特征。

現(xiàn)有研究表明，某些重要的多糖成分具有抗AS病變的作用[10,11]。本研究以GLPs干預(yù)基于基因修飾技術(shù)的AS動物模型，結(jié)果顯示，GLPs組ApoE-/-小鼠血清TC、TG、LDL-C含量明顯降低，且各劑量組的TC、LDL-C水平及GLPs低劑量組的TG水平與模型組相比具有統(tǒng)計學(xué)意義；同時，GLPs組小鼠血清的HDL-C含量也呈上升趨勢，且高劑量組具有統(tǒng)計學(xué)意義。實驗結(jié)果表明，GLPs對ApoE-/-小鼠AS病變具有一定的調(diào)節(jié)和治療作用，其機制可能與調(diào)節(jié)機體血脂代謝水平，抑制血清炎癥因子，減少脂質(zhì)浸潤等作用有關(guān)，這為GLPs防治AS的臨床應(yīng)用提供相應(yīng)的理論和實驗基礎(chǔ)。

AS炎癥學(xué)說表明，單核細胞與血管內(nèi)皮細胞粘附、內(nèi)膜巨噬細胞聚集、平滑肌細胞遷移和增殖、以及細胞外基質(zhì)聚集等多個環(huán)節(jié)均依賴于血管細胞黏附分子-1(VCAM-1)、ICAM-1等黏附分子的作用[12]。ICAM-l 在促進免疫細胞浸潤的基礎(chǔ)上使單核細胞和淋巴細胞黏附并遷移至內(nèi)皮下，單核細胞進而分化為巨噬細胞-泡沫細胞，促進AS的發(fā)生發(fā)展。而TNF-α作為炎癥反應(yīng)關(guān)鍵性因子，可直接作用于血管內(nèi)皮細胞導(dǎo)致其損傷，還可通過誘導(dǎo)ICAM-1、VCAM-1等黏附分子的表達來促進白細胞、單核細胞、淋巴細胞等與血管內(nèi)皮細胞的黏附及遷移，加速AS進程[13]。與此同時，ox-LDL作為致AS病變的獨立危險因素，通過其特異性受體LOX-l結(jié)合、攝取及降解并介導(dǎo)其生物學(xué)功能。TLR4/NF-κB途徑通過上調(diào)LOX-1的表達引發(fā)促炎因子和黏附分子表達的升高，而LOX-1本身也可作為內(nèi)皮黏附分子加速ox-LDL對AS疾病進程中內(nèi)皮細胞的損傷[14]。因此，LOX-1、TNF-α及ICAM-1等炎癥因子的改變與AS病變進程密切相關(guān)。本研究結(jié)果顯示，與正常組相比，模型組小鼠誘導(dǎo)LOX-1、TNF-α及 ICAM-1 mRNA表達均顯著升高。采用GLPs干預(yù)后，LOX-1、TNF-α及ICAM-1水平相較于模型組均明顯下降，并具有統(tǒng)計學(xué)意義。因此，推測GLPs對 LOX-1、TNF-α和 ICAM-1表達均具有抑制作用。GLPs通過對炎性因子和細胞間黏附分子表達的抑制，減少單核細胞與血管內(nèi)皮細胞粘附，減少炎性損傷，延緩病情發(fā)展，這可能是其防治AS的機制之一。

“炎癥學(xué)說”貫穿于AS發(fā)生和發(fā)展的全過程，已成為AS發(fā)病機制的主流學(xué)說之一[15]。本研究中藥治療組的血脂及LOX-1、TNF-α和 ICAM-1等指標下降趨勢并未顯示明顯的濃度依賴性，這與中藥在適當(dāng)劑量時起效慢、療程長的現(xiàn)象相吻合。GLPs是靈芝中最有效的成分之一，但多糖結(jié)構(gòu)復(fù)雜，本身即具有雙向調(diào)節(jié)作用，而中藥的雙向調(diào)節(jié)作用主要受藥物自身特點、藥物劑量、配伍、炮制加工、藥物代謝動力學(xué)、機體功能狀態(tài)等因素的影響。因此，GLPs最適宜劑量還需通過調(diào)整相應(yīng)用藥量、用藥時間及方式等來加以改善。本部分實驗為中醫(yī)藥防治AS提供了新靶點和理論依據(jù)。

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