蒲歡，劉應(yīng)才

(西南醫(yī)科大學(xué)附屬醫(yī)院，四川瀘州646000)

目前，我國動(dòng)脈粥樣硬化相關(guān)心腦血管疾病發(fā)病率及病死率居高不下，且支架置入病人也不斷增多[1]。血管平滑肌細(xì)胞(VSMCs)異常增殖是動(dòng)脈粥樣硬化及支架內(nèi)再狹窄的重要病理生理過程[2]。中電導(dǎo)鈣激活鉀通道(KCa3.1)是由6個(gè)跨膜區(qū)域組成的非電壓依賴性離子通道，近年來發(fā)現(xiàn)其在心室重塑、動(dòng)脈粥樣硬化等病理生理過程中扮演重要角色[3,4]。槲皮素(Que)是最豐富的膳食黃酮。在心血管方面，Que有抗血小板聚集、降低血壓、調(diào)節(jié)血脂、防治支架術(shù)后再狹窄等作用[5]。已知Que對(duì)VSMCs增殖具有抑制作用，但是否通過KCa3.1發(fā)揮作用尚不明確。2016年12月～2017年6月本實(shí)驗(yàn)通過培養(yǎng)大鼠VSMCs,觀察Que對(duì)血管緊張素Ⅱ(AngⅡ)誘導(dǎo)VSMCs 增殖的影響，并探討其與KCa3.1的關(guān)系。

1 材料與方法

1.1 動(dòng)物與主要試劑 清潔級(jí)SD大鼠，體質(zhì)量150～180g，由西南醫(yī)科大學(xué)實(shí)驗(yàn)動(dòng)物中心提供。澳洲胎牛血清(Bovogen)，DMEM/高糖培養(yǎng)基 (HyClone)，Que、CCK-8試劑盒(Sigma)，胰蛋白酶(碧云天)，TRAM 34(Selleck)，KCa3.1 antibody (Abcam)，AngⅡ(大連美侖)，PBS、BCA蛋白濃度測定試劑盒(APSEN)，大鼠Anti-αSMA (博士德)。

1.2 大鼠胸主動(dòng)脈VSMCs培養(yǎng)及鑒定 采用組織貼塊法培養(yǎng)VSMCs，培養(yǎng)3 d換液1次，5～7 d可見細(xì)胞從組織塊游離出，10～14 d組織塊周圍的細(xì)胞出現(xiàn)融合，呈波峰波谷樣生長。采用抗大鼠α-SMA 抗體進(jìn)行免疫組織化學(xué)染色鑒定證實(shí)為VSMCs。用臺(tái)盼藍(lán)染色細(xì)胞計(jì)數(shù)法檢測細(xì)胞活性。

1.3 實(shí)驗(yàn)分組 在37 ℃、5% CO2飽和濕度培養(yǎng)箱中培養(yǎng)VSMCs，待單層細(xì)胞鋪滿培養(yǎng)瓶80%以上時(shí)采用酶消化法進(jìn)行傳代。實(shí)驗(yàn)均采用3～5代細(xì)胞。實(shí)驗(yàn)先分為：對(duì)照組(只加入培養(yǎng)液)、AngⅡ組(10-6mol/L AngⅡ培養(yǎng)48 h)、AngⅡ+ TRAM 34(KCa3.1特異性阻滯劑)組(加入終濃度100 nmol/L TRAM 34預(yù)先處理2 h，再AngⅡ培養(yǎng)48 h)、AngⅡ+20 μmol/L Que組(先加入終濃度分別為20 μmol/L Que培養(yǎng)2 h，再加Ang Ⅱ培養(yǎng)48 h)、AngⅡ+40 μmol/L Que組(先加入終濃度分別為40 μmol/L Que培養(yǎng)2 h，再加Ang Ⅱ培養(yǎng)48 h)、AngⅡ+80 μmol/L Que組(先加入終濃度分別為80 μmol/L Que培養(yǎng)2 h，再加Ang Ⅱ培養(yǎng)48 h)、AngⅡ+TRAM 34+80 μmol/L Que (加入終濃度100 nmol/L TRAM 34及80 μmol/L Que培養(yǎng)2 h，再AngⅡ培養(yǎng)48 h)。

1.4 細(xì)胞增殖率檢測 采用CCK-8法。選擇對(duì)數(shù)生長期細(xì)胞用胰蛋白酶消化，配制成濃度為1×105/mL的細(xì)胞懸液，按10 000細(xì)胞/孔接種于96孔板，每孔加100 μL，置于5%CO2培養(yǎng)箱中37 ℃下培養(yǎng)24 h以貼壁。換1%FBS-DMEM培養(yǎng)基繼續(xù)培養(yǎng)24 h后，進(jìn)行加藥100 μL。每組設(shè)3個(gè)復(fù)孔。培養(yǎng)實(shí)驗(yàn)所需時(shí)間后所有孔中加入10 μL CCK-8溶液，培養(yǎng)箱中孵育1～4 h。使用酶標(biāo)儀測定450 nm波長下吸光度，以不含細(xì)胞的培養(yǎng)基為空白組，按公式計(jì)算藥物對(duì)細(xì)胞的增殖率。細(xì)胞增殖率=(實(shí)驗(yàn)組吸光度-空白組吸光度)/(對(duì)照組吸光度-空白組吸光度)×100%。

1.5 Kca3.1通道蛋白表達(dá)檢測 采用Western blotting法。用TBS緩沖液潤洗貼壁細(xì)胞2～3次。加入適當(dāng)體積的細(xì)胞總蛋白提取試劑于培養(yǎng)瓶內(nèi)裂解3～5 min。期間反復(fù)晃動(dòng)培養(yǎng)瓶，使試劑與細(xì)胞充分接觸。將細(xì)胞刮下，收集到1.5 mL離心管中，冰浴30 min，期間用移液器反復(fù)吹打。4 ℃ 13 000 g離心5 min，收集上清，即為總蛋白溶液，使用BCA蛋白質(zhì)濃度測定試劑盒測定樣品蛋白濃度。制膠，加入TEMED后立即搖勻灌膠。進(jìn)行電泳分離(濃縮膠80 V、分離膠120 V)轉(zhuǎn)膜PVDF膜甲醇活化。按照正負(fù)極的方向擺放轉(zhuǎn)膜“三明治”結(jié)構(gòu)，300 mA恒流轉(zhuǎn)磨90 min。將轉(zhuǎn)好的膜加入封閉液室溫封閉1 h，除去封閉液，加入已稀釋好的一抗4 ℃過夜。回收已稀釋的一抗，用TBST洗3次，每次5 min。加入稀釋好的二抗，室溫孵育30 min，用TBST在室溫下?lián)u床上洗4次，每次5 min。用化學(xué)發(fā)光顯影法進(jìn)行顯影，以分析軟件Alpha Imager 2200分析產(chǎn)物的光密度值(灰度比值=蛋白條帶灰度/內(nèi)參照蛋白條帶灰度)。

2 結(jié)果

與正常對(duì)照組比較，AngⅡ組細(xì)胞增殖率明顯增加(P<0.05)。與AngⅡ組比較，AngⅡ+TRAM 34組、AngⅡ+20、40、80 μmol/L Que組細(xì)胞增殖率降低(P均<0.05)。與Ang Ⅱ+TRAM 34組相比，Ang Ⅱ+TRAM 34+80 μmol/L Que組細(xì)胞增殖率降低(P<0.05)。與對(duì)照組比較，AngⅡ組Kca3.1通道蛋白表達(dá)增加(P<0.05)。與AngⅡ組相比，AngⅡ+TRAM 34組、AngⅡ+20、40、80 μmol/L Que組Kca3.1通道蛋白降低(P均<0.05)。AngⅡ+ TRAM 34 +80 μmol/L Que組與AngⅡ+ TRAM 34組相比，KCa3.1表達(dá)未見明顯異常(P>0.05)。見表1。

表1 各組VSMCs增殖率及Kca3.1通道蛋白 表達(dá)比較

注：與對(duì)照組比較，*P<0.05；與AngⅡ比較，#P<0.05；與Ang II+TRAM34組比較，&P<0.05。

3 討論

動(dòng)脈粥樣硬化是眾多心腦血管疾病共同的病理基礎(chǔ)，嚴(yán)重危害人類健康，其并發(fā)癥已然成為全球負(fù)擔(dān)[6]。目前認(rèn)為探索治療動(dòng)脈粥樣硬化的新方法，將依賴于對(duì)疾病過程中主要細(xì)胞的生物學(xué)特性及致病機(jī)制進(jìn)行嚴(yán)格認(rèn)識(shí)。對(duì)于VSMCs，未來一個(gè)重要目標(biāo)是確定影響其生物學(xué)行為的有益的因素和機(jī)制，可以增強(qiáng)或取代傳統(tǒng)的抗動(dòng)脈粥樣硬化治療。RAAS系統(tǒng)激活是動(dòng)脈粥樣硬化發(fā)病機(jī)制之一，AngⅡ通過刺激黏附分子、趨化因子和細(xì)胞因子的表達(dá)，促進(jìn)內(nèi)皮功能障礙、低密度脂蛋白的攝取和細(xì)胞增殖等，從而促進(jìn)動(dòng)脈粥樣硬化的形成。多種病理刺激可以致平滑肌細(xì)胞增殖，RASS系統(tǒng)也在其中發(fā)揮重要作用。AngⅡ與細(xì)胞表面AT1R結(jié)合，從而通過Rho激酶、MAPK、NAPDH/ROS等信號(hào)通路，改變一氧化氮、Ca2+濃度，調(diào)控miR-221, miR-146a等微小RNA表達(dá)及影響各種內(nèi)源性促有絲分裂因子來使平滑肌細(xì)胞發(fā)生表型轉(zhuǎn)變、增殖、遷移、鈣化等[2,7]。目前心血管疾病治療過程中，抑制RASS系統(tǒng)激活已被指南廣泛推薦。

Que是種植物源性五羥基黃酮類化合物。在過去幾十年里，越來越多的證據(jù)表明健康飲食中天然來源的雜環(huán)化合物對(duì)調(diào)節(jié)人的健康有重要作用。流行病學(xué)證據(jù)也報(bào)道，富含黃酮類物質(zhì)的飲食有益于心血管疾病的一級(jí)預(yù)防和二級(jí)預(yù)防[8]。大量研究表明在動(dòng)脈粥樣硬化方面，Que可以通過降低血管內(nèi)炎癥反應(yīng)、改善內(nèi)皮功能、抗血小板聚集、降血脂等方面發(fā)揮作用[7]。但Que在臨床的應(yīng)用仍有許多方面困擾著我們，如安全性、生物學(xué)形式及生物利用度等。關(guān)于Que在人體的安全性問題，大量研究表明Que是安全的，人體攝入1 000 mg/d的Que對(duì)血壓、肝腎功、血常規(guī)無明顯影響，但其毒副作用仍存在[9,10]。盡管Que作用眾多，但其發(fā)揮作用需要特定的生物學(xué)形式，而其抑制細(xì)胞增殖的多種機(jī)制在不同系統(tǒng)是否一致仍需進(jìn)一步研究。我們?nèi)孕韪嗟幕A(chǔ)、臨床研究及更高的制藥技術(shù)來解決這些問題。針對(duì)VSMCs，已有研究表明Que可以抑制VSMCs增殖和遷移[5,11]，與我們此次實(shí)驗(yàn)結(jié)果一致。在本實(shí)驗(yàn)中，與AngⅡ組相比，Que呈濃度依賴性抑制VSMCs增殖，但具體機(jī)制仍需進(jìn)一步探索。目前，關(guān)于Que能否通過KCa3.1來抑制VSMCs增殖的研究較少。

KCa3.1即中電導(dǎo)鈣激活鉀通道，是鈣激活鉀通道家族中的一員。因細(xì)胞內(nèi)Ca2+升高而激活，可促使K+外流，進(jìn)而調(diào)節(jié)細(xì)胞膜電位和細(xì)胞內(nèi)鈣信號(hào)。KCa3.1在參與心血管疾病發(fā)生的許多細(xì)胞中上調(diào)，如激活的T細(xì)胞、B細(xì)胞、巨噬細(xì)胞、血小板、VSMCs和成纖維細(xì)胞，提示其可能在動(dòng)脈粥樣硬化、再狹窄和心臟纖維化等發(fā)生中起作用[3]。近年來相關(guān)研究已表明分化狀態(tài)、靜止、收縮表型的VSMCs優(yōu)勢表達(dá)KCa3.1。但在血管增生性疾病，在許多炎癥因子、剪切力、氧化應(yīng)激等作用下，VSMCs發(fā)生表型調(diào)整，KCa3.1快速上調(diào)，從而介導(dǎo)其生物學(xué)行為的改變[3,12,13]。KCa3.1能否作為一個(gè)治療動(dòng)脈粥樣硬化及其他心血管疾病新的靶點(diǎn)正在進(jìn)一步研究。且在阻斷該離子通路對(duì)小鼠未產(chǎn)生毒副作用，也不影響其對(duì)流感病毒的免疫反應(yīng)，且未在小鼠及服用KCa3.1阻滯劑Senicapoc的人上觀察到對(duì)血壓影響[14]，這些使這個(gè)通道臨床應(yīng)用成為可能。而我們的研究也表明，與對(duì)照組相比，AngⅡ刺激下KCa3.1通道蛋白明顯增加。而加入KCa3.1特異性阻滯劑TRAM 34后VSMCs增殖明顯被抑制，因此，抑制KCa3.1通路將抑制VSMCs增殖。在本次試驗(yàn)中，我們繼續(xù)探討Que抑制AngⅡ誘導(dǎo)的VSMCs增殖是否與KCa3.1有關(guān)。結(jié)果發(fā)現(xiàn)，Que能抑制AngⅡ誘導(dǎo)的Kca3.1通道蛋白的增加，而KCa3.1特異性阻滯劑TRAM 34能消除這種作用。Ang Ⅱ+TRAM 34+80 μmol/L Que組與Ang Ⅱ+TRAM 34組相比，兩組的細(xì)胞增殖有差異性，說明表明Que可以通過抑制KCa3.1來抑制VSMCs增殖，但并不是其唯一的機(jī)制。

綜上，Que可以通過調(diào)控KCa3.1來調(diào)節(jié)VSMCs增殖。目前隨著制藥工藝的進(jìn)展，使Que生物利用度的提高成為可能，深入研究Que在參與動(dòng)脈粥樣硬化的各類型細(xì)胞中的作用有助于運(yùn)用其防治動(dòng)脈粥樣硬化。

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