黃映紅，曾潔萍，張淼，謝茜

近年來，骨髓源性間充質干細胞（Bone marrow mesenchymal stem cell, bMSC ）通過細胞替代和營養(yǎng)支持治療缺血性腦卒中的應用越來越受到關注[1～2]。但bMSC在缺血損傷微環(huán)境下存活率低、分化失調、難以定向遷移等問題的存在限制了其臨床應用。增強bMSC對損傷微環(huán)境的耐受性是解決問題的關鍵。研究表明，缺血缺氧等損傷因素會誘導細胞發(fā)生內質網應激（endoplasmic reticulum stress，ERS），激活未折疊蛋白反應（unfolded protein reaction,UPR），進而通過觸發(fā)泛素酶體途徑以減輕內質網負荷、維持內質網穩(wěn)態(tài)。但當UPR介導的適應性反應仍難以減少錯誤折疊的蛋白質時，內質網穩(wěn)態(tài)終將失衡，內質網應激將作為觸發(fā)信號，最終導致細胞凋亡[3]。本研究以缺氧/復氧環(huán)境下bMSC內質網穩(wěn)態(tài)失衡為切入點，旨在探討補腎活血中藥復方對bMSC的保護作用及機制。

1 材料和方法

1.1 材料

1.1.1 實驗用動物 bMSC分離用4～5周齡SPF級SD大鼠（體重約100g～120g），雌雄不限；含藥血清制備選用8～10周齡SPF級SD大鼠（體重200±20g），雌雄各半。以上實驗用動物均由成都達碩生物科技有限公司提供，動物許可證：SCXK（川）2015-30。

1.1.2 實驗用藥物及主要試劑 補腎活血方組成：熟附片5 g，巴戟天15 g，山茱萸15 g，熟地20 g，肉蓯蓉15 g，五味子15 g，麥冬15 g，石菖蒲10 g，遠志10 g，丹參15 g，當歸20 g，川芎10 g。購自成都中醫(yī)藥大學附屬醫(yī)院；依達拉奉注射液（昆明積大制藥股份有限公司，170513）；低糖DMEM（Hyclone，SH30021.01）；胎牛血清（Cellmax，SA212.01）；MTT試劑盒（購自南京建成）；兔抗ATF6抗體（Proteintech group，24169-1-AP）；兔抗Tublin抗體（Cell Signaling Technology，2148）；BCA蛋白定量試劑盒（Cell Signaling Technology，7780）；反轉錄試劑盒（Aidlab，TUREscript 1st Stand cDNA SYNTHESIS Kit）；2×SYBR? Green預混液（德國DBI）。

1.2 補腎活血方含藥血清的制備

補腎活血方全方用水浸泡后濃煎取汁，制備濃度為含原生藥11.88、5.94、2.97 g﹒mL-1的高劑量、中劑量和低劑量水煎液。

取8～10周齡的SPF級SD大鼠40只，隨機分為空白組、中藥高、中、低劑量組，每組10只。中藥高、中、低劑量組分別給予含原生藥59.4、29.7、14.85 g﹒kg-1的補腎活血方水煎液，分別相當于按體表面積折算成人用藥等效劑量4、2、1倍。空白組大鼠給予等體積生理鹽水。各組均灌胃2 次/d，連續(xù)3d。第3 d最后一次給藥后禁食12 h，于第4天一次性給予全天劑量，1 h后股靜脈取血。全血于4℃下靜置2 h，3000 rpm離心15 min，取上層清亮液體，抽濾除菌，同組血清混和，56℃條件下滅活30 min，分裝，-20℃保存?zhèn)溆谩?/p>

1.3 大鼠bMSC的分離、培養(yǎng)和鑒定

取4～5周齡SD大鼠，腹腔注射10%水合氯醛，麻醉后處死動物。75%乙醇浸泡10 min，無菌條件下取大鼠雙側股骨、脛骨，去除干骺端，DMEM反復沖洗骨髓腔直至骨髓腔變白，收集沖洗液，200目篩過濾，收集濾液，1200 rpm離心5 min，棄上清，向沉淀加入紅細胞裂解液，冰浴15 min，1500 rpm離心5 min，收集沉淀，PBS洗滌2次，用12%L-DMEM重懸細胞，并接種于75cm2培養(yǎng)瓶，37 ℃、5 % CO2 及完全飽和濕度條件下孵育。48 h半量換液，72 h全量換液，以后每48h換液一次，原代細胞達到80%融合后，按1:2傳代，取2～3代細胞用于后續(xù)實驗。

取2～3代bMSCs接種于預置蓋玻片的6孔培養(yǎng)板中，37℃、5 % CO2及完全飽和濕度條件下培養(yǎng)，制成細胞爬片。當細胞生長至70 %融合時取出玻片，行細胞免疫化學染色。CD44陽性表達，但不表達CD34的細胞為bMSC。

1.4 實驗分組

取2～3代細胞接種于96孔板或6孔板，分為6組：①空白對照組：每孔加入含20%空白組血清的L-DMEM培養(yǎng)液；②模型對照組：每孔加入含20%空白組血清L-DMEM培養(yǎng)液；③中藥高劑量組：每孔加入含20%高劑量補腎活血方血清的L-DMEM培養(yǎng)液；④中藥中劑量組：每孔加入含20%中劑量補腎活血方血清的L-DMEM培養(yǎng)液；⑤中藥低劑量組：每孔加入含20%低劑量補腎活血方血清的L-DMEM培養(yǎng)液；⑥依達拉奉組：每孔加入含300 μmol﹒L-1依達拉奉注射液的L-DMEM培養(yǎng)液。

1.5 缺氧/復氧模型制備

缺氧處理前各組細胞均更換無血清培養(yǎng)液，5%CO2、37℃細胞培養(yǎng)箱中孵育24 h，使細胞同步化。按實驗分組更換相應的含藥血清培養(yǎng)液和含藥培養(yǎng)液，迅速將除空白對照組以外的其它幾組細胞放入已預置缺氧化學催化劑（Anaero Pack，日本三菱）及缺氧指示條的缺氧盒中，密封缺氧盒，37℃條件下孵育6 h。6 h后從缺氧盒中取出培養(yǎng)板，5%CO2、37℃條件下再孵育2 h，終止培養(yǎng)。

1.6 MTT法測定細胞存活率

取3代對數生長期的bMSC，按2×104個/mL接種于96孔板（空白對照組單獨鋪板，另五組細胞鋪于同一塊96孔板），每孔0.1 mL，培養(yǎng)24 h，細胞貼壁生長，細胞分組及給藥同1.4，每組10孔。細胞模型制備同1.5。37℃、5 % CO2及完全飽和濕度條件下孵育24 h后，每孔加入1× MTT溶液50 μL，37 ℃孵育4 h，棄孔內液體，每孔加150 μLDMSO，水平搖床振蕩10 min，Tecan In finite M200 pro酶標儀 于570 nm波長處檢測A570。細胞存活率=（實驗組A570/空白組A570）×100%

1.7 Real-time PCR測定CHOP mRNA的相對表達量

使用 TRIZOL試劑提取細胞總RNA，用1%非變性瓊脂糖凝膠電泳，然后用紫外凝膠成像系統(tǒng)觀察RNA的完整性。所得RNA采用Aidlab公司反轉錄試劑盒反轉錄為cDNA，設計引物后對PCR進行擴增。PCR反應在analytikjena-qTOWER2.2型熒光定量PCR儀上進行，每個樣品均重復三次以避免加樣誤差，分析方法為ΔΔCt法。

根據NCBI公布的基因序列分別設計熒光定量PCR引物，選取GAPDH作為內參基因。引物設計如下表：

表1 Q-PCR引物序列

1.8 Western blotting 測定ATF6的相對表達量

提取各組大鼠bMSC的總蛋白，采用BCA法測定總蛋白濃度，Western blotting檢測 bMSC 的ATF6表達水平，ATF6一抗1:500稀釋，ɑ-Tublin一抗1:1000稀釋，二抗 1:1000稀釋。掃描PVDF膜上各條帶，Image J分析各條帶的平均光密度值，取目的蛋白與內參ɑ-Tubulin平均光密度值的比值，表示bMSC內ATF6的相對表達量，并比較各組細胞ATF6相對表達量的差異。

1.9 統(tǒng)計分析

統(tǒng)計分析采用SPSS 22.0軟件進行處理，計量數據均以±S表示，均數間的兩兩比較采用成組t檢驗，以P＜0.05表示差異有統(tǒng)計學意義。

2 結果

2.1bMSC形態(tài)觀察

原代有核細胞48～72 h完全貼壁，貼壁細胞呈梭形，細胞核為卵圓形。原代細胞于6～8 d進入對數生長期，細胞克隆化生長，形成大小不一的集落，12～15 d達到80%～90%融合。傳代細胞呈長梭形，24 h左右完全貼壁，4～5 d進入對數生長期。(見圖1)

圖1 倒置顯微鏡下bMSC的形態(tài)特征（100×）

2.2 補腎活血方對缺氧/復氧環(huán)境下bMSC存活率的影響

與空白對照組比較，模型對照組bMSC存活率明顯降低（P＜0.01）；與模型對照組比較，補腎活血方高、中、低劑量組和依達拉奉組bMSC存活率顯著增高（P＜0.05或P＜0.01）。（見表2）

表2 各組bMSC存活率的比較（x±S ，n=10）

2.3 補腎活血方對缺氧/復氧環(huán)境下bMSC中ATF6表達的影響

與空白對照組比較，模型對照組bMSC內ATF6相對表達量顯著增高（P＜0.05）；與模型對照組比較，補腎活血方高劑量組bMSC內ATF6相對表達量顯著降低（P＜0.01）。（見圖2）

注：與空白對照組比較：*P＜0.05；與模型對照組比較：P＜0.05，P＜0.01

注：C代表空白對照組，M代表模型對照組，D代表中藥低劑量組，Z代表中藥中劑量組， G代表中藥高劑量組，E代表依達拉奉組

2.4 補腎活血方對缺氧/復氧環(huán)境下bMSC中CHOP mRNA表達的影響

與空白對照組比較，模型對照組bMSC內CHOP mRNA的相對表達量顯著增高（P＜0.01）；與模型對照組比較，補腎活血方高劑量組、中劑量組及依達拉奉組bMSC內CHOP mRNA的相對表達量顯著降低（P＜0.05或P＜0.01）。（見圖3）

注：與空白對照組比較：*P＜0.05，**P＜0.01；與模型對照組比較：P＜0.05，P＜0.01

3 討論

bMSC是來源于骨髓的一種具有跨胚層分化潛能的成體干細胞，其在缺血損傷腦組織中的定植分化、旁分泌等效應有助于修復受損組織[4～5]。目前認為，bMSC所具有的內在分化程序、所處微環(huán)境中的神經營養(yǎng)因子、細胞外基質、黏附分子等因素與其增殖、分化密切相關。但腦缺血再灌注后，各種復雜的原發(fā)和繼發(fā)事件(如炎癥因子的釋放、神經血管單元的受損和細胞死亡、各種損傷和抗損傷事件的對抗等)嚴重影響了bMSC的存活。因此，增強bMSC對損傷微環(huán)境的耐受性是干細胞研究中不容忽視的環(huán)節(jié)。

本研究選用補腎經典方—地黃飲子配伍活血化瘀常用藥物組成補腎活血方。地黃飲子出自劉河間《黃帝素問·宣明論方》，為臨床治療缺血性腦損傷的有效方[6～7]。方中附子、巴戟天、肉蓯蓉補腎陽，山茱萸、熟地填腎精，麥冬、五味子補陰，當歸、丹參、川芎養(yǎng)血活血，菖蒲、遠志化痰開竅，全方陰陽并補，水火相濟，共奏補腎填精、祛瘀化痰之功。實驗研究亦表明地黃飲子具有明確的神經保護作用，其機制可能為改善HPA軸的紊亂、抗氧化和清除自由基、抑制神經元凋亡、促進內源性神經干細胞增殖等[8～10]。另有研究證實，地黃飲子含藥血清孵育bMSC，能顯著提高bMSC移植對缺血性腦卒中的治療效果[11～12]。但有關地黃飲子對缺血損傷微環(huán)境中bMSC的保護作用及機制研究，還鮮有文獻報道。

內質網是蛋白質翻譯后修飾、折疊組裝的場所。缺血、缺氧等病理因素破壞內質網穩(wěn)態(tài)，則會引發(fā)ERS，表現為大量錯誤折疊或未折疊的蛋白質在內質網聚集，并啟動從內質網到細胞質和細胞核的一系列信號轉導。內質網膜上存在三類感受器：蛋白激酶樣內質網激酶（protein kinase R-like ER kinase，PERK）、激活作用轉錄因子-6（activating transcription factor 6，ATF6）、跨膜蛋白激酶1（inositol-requiring enzyme 1，IRE1）。早期ERS通過介導三條UPR信號通路，即PERK通路、ATF6通路、IRE1通路，以抑制蛋白質合成、減輕內質網負荷，或提高蛋白質折疊能力，或通過內質網相關性蛋白質降解途徑清除未折疊和錯誤折疊蛋白質，以恢復內質網穩(wěn)態(tài)，使細胞繼續(xù)存活。但如細胞遭受的刺激過強或ERS持續(xù)時間過長，細胞難以維持或重建內質網穩(wěn)態(tài)時，內質網就會作為凋亡信號的發(fā)起點[13～14]。內質網應激信號通路中重要信號分子—CCAAT增強子結合蛋白同源蛋白(C/EBP homologous protein,CHOP)可通過激活下游基因如DOCs（downstream of CHOP）或caspase-1誘導細胞凋亡，故CHOP的表達上調是ERS誘導凋亡的關鍵環(huán)節(jié)[15]。因此，阻斷ATF6通路、下調CHOP的表達，減輕因缺血缺氧導致的內質網應激，進而抑制細胞凋亡，是神經保護藥物治療缺血性腦損傷的重要機制[16]。

本研究結果顯示，缺氧6 h/復氧2 h誘導下，bMSC存活率明顯降低；與此同時，bMSC中內質網應激相關基因ATF6、CHOP的表達豐度明顯增加。這一結果提示模擬缺血/再灌注損傷導致bMSC內質網應激發(fā)生，而bMSC存活率的降低與持續(xù)存在的ERS密切相關。給予補腎活血方含藥血清處理可顯著增強bMSC對缺氧損傷環(huán)境的耐受性，提高細胞存活率，該方的細胞保護作用機制可能為抑制bMSC內質網應激，從而阻斷細胞凋亡。