王秀英 蘭創(chuàng)業(yè) 趙軍良 李改珍

（山西省農(nóng)業(yè)科學(xué)院蔬菜研究所，山西 太原 030031）

組培過程中，培養(yǎng)基和培養(yǎng)材料受外界真菌、細(xì)菌或培養(yǎng)材料的內(nèi)生菌侵染滋生雜菌，導(dǎo)致組培失敗，稱為組培污染[1]。從污染產(chǎn)生的病原來看主要有真菌和細(xì)菌兩類[2]，操作不當(dāng)、外植體消毒不充分、培養(yǎng)基及工具消毒不過關(guān)、無菌操作室消毒時間過短、無菌操作程序不嚴(yán)格等都會造成污染[3]。各種因素引起的組培污染一直最大程度地制約著組培技術(shù)的發(fā)展[4]。

我們在大白菜游離小孢子培養(yǎng)過程中發(fā)現(xiàn)，花蕾的選擇、清洗、消毒、研磨、離心、分裝、培養(yǎng)等環(huán)節(jié)的操作都要嚴(yán)格按照操作規(guī)程，否則極易造成污染。目前，國內(nèi)報道較多的影響大白菜游離小孢子胚誘導(dǎo)率的因素有基因型[5～10]、小孢子發(fā)育時期[11～12]、培養(yǎng)方式[13]、供體植株生長環(huán)境條件[5，14～15]等，影響胚誘導(dǎo)再生植株的因素有胚的類型、培養(yǎng)基水分狀況、活性炭[16～17]等，而對培養(yǎng)過程中存在的污染問題及防治措施報道較少。

大白菜的開花期有1個月左右，始花期后期和盛花期前期是小孢子培養(yǎng)取材的最佳時期，適宜取材接種的時間很短，只有10 d左右，培養(yǎng)過程中應(yīng)盡量避免污染導(dǎo)致培養(yǎng)失敗。多年來我們一直從事大白菜小孢子培養(yǎng)工作，在培養(yǎng)過程中的污染問題及防控措施方面積累了一些經(jīng)驗，現(xiàn)將其介紹如下。

1 污染問題

1.1 細(xì)菌性污染

培養(yǎng)過程中肉眼觀察到培養(yǎng)基呈黏稠狀或顯微鏡觀察到細(xì)胞已團(tuán)集而不再均勻分散，是細(xì)菌性污染的主要癥狀，一般在接種后1～3 d即可發(fā)現(xiàn)是否發(fā)生細(xì)菌性污染。細(xì)菌性污染一般由接種工具、培養(yǎng)基、洗液、無菌水、花蕾等消毒不徹底，操作不規(guī)范造成的。

1.2 真菌性污染

真菌性污染常發(fā)生在培養(yǎng)后期，培養(yǎng)基上出現(xiàn)黑、綠、紅、黃、白不同顏色，不同大小的菌斑是發(fā)生真菌性污染的癥狀。真菌性污染發(fā)生的主要原因有存放培養(yǎng)基的環(huán)境中真菌孢子濃度過大、培養(yǎng)基瓶口密封不嚴(yán)、接種材料多、接種時間長、超凈工作臺濾網(wǎng)不干凈、空氣中有真菌孢子漂浮等。真菌性污染的發(fā)生癥狀會隨著培養(yǎng)時間的延長而表現(xiàn)出來。

2 防治對策

游離小孢子培養(yǎng)接種前要認(rèn)真挑選材料、嚴(yán)格滅菌，接種時規(guī)范操作，接種后調(diào)控培養(yǎng)環(huán)境，嚴(yán)防病原菌侵入，將污染率降到最低。

2.1 接種前

2.1.1 試驗材料的選擇

選擇無蟲眼、無裂縫、表面光滑的花蕾和清澈透明的培養(yǎng)基作為試驗材料，避免消毒不徹底而造成污染。

2.1.2 培養(yǎng)基滅菌

花粉培養(yǎng)用的NLN液體培養(yǎng)基主要通過過濾除菌，一般需過濾2～3次，過濾每L培養(yǎng)基需耗時10多h，將過濾后的培養(yǎng)基分裝于不同的三角瓶中，在常溫下觀察1周多。如果污染嚴(yán)重，第2 d培養(yǎng)基就會出現(xiàn)渾濁；如果污染輕微，第2 d、第3 d培養(yǎng)基仍然透明，但隨著時間的延長會看到白色棉絮狀漂浮物由小變大。液體培養(yǎng)基除菌過程中的過濾器及相關(guān)器皿都要嚴(yán)格消毒，并在超凈工作臺上進(jìn)行過濾。

2.1.3 B5洗液、無菌水、接種工具等高壓蒸汽滅菌

滅菌前設(shè)定溫度和時間，冷空氣要排放干凈，避免壓力表上的溫度和壓力指標(biāo)與鍋內(nèi)實際溫度和壓力不符而導(dǎo)致滅菌不徹底；液體最多占容器體積的2/3，避免液體沖破封口膜造成污染；固體器皿包裹后均勻擺放在鍋內(nèi)，切不可擁擠堆放使蒸汽流通和熱交換受阻，導(dǎo)致滅菌不徹底；滅菌結(jié)束后，待指針歸零時才能取出消毒物品，切忌打開放氣閥急速放氣，降溫太快會導(dǎo)致滅菌不徹底。根據(jù)滅菌對象不同，滅菌時間長短也不同。洗液、無菌水等液體，滅菌時間為30 min左右，需冷卻后使用；燒杯、試管、玻璃棒、離心管、吸管、鑷子、培養(yǎng)皿等器皿，滅菌時間為20 min左右，滅菌后將器皿放入烘箱烘干備用。

2.2 接種過程中

2.2.1 接種室和超凈工作臺的滅菌

保持接種室清潔，定期打開紫外燈殺菌，接種前噴灑75%酒精降塵；接種前打開超凈工作臺的紫外燈殺菌20～30 min，提前20 min打開鼓風(fēng)機(jī)，保證超凈工作臺內(nèi)部氣流暢通，勤洗過濾網(wǎng)，使空氣潔凈無雜菌；接種前對臺面、試管架、酒精瓶及工具進(jìn)行徹底消毒。接種時用75%酒精擦拭雙手，點燃酒精燈，拉下?lián)躏L(fēng)玻璃，僅夠接種人員伸入雙手操作即可。

2.2.2 材料表面的消毒

挑選好的花蕾先用自來水沖洗干凈，然后在超凈工作臺上用75%酒精浸泡約30 s后迅速浸入0.1%升汞溶液中消毒5～10 min[18]，或用7%次氯酸鈉消毒15 min。材料消毒后用無菌水沖洗3次，每次5 min。

2.2.3 研磨和過濾

將鑷子和玻璃棒蘸上酒精在酒精燈外焰上充分灼燒，冷卻后備用；將離心管和濾斗用鑷子夾夾在一起放到試管架上。整個操作過程忌互相碰撞，接觸部位需在酒精燈上灼燒消毒。將消毒后的花蕾放入試管內(nèi)，倒入一定量的洗液，用玻璃棒輕輕擠壓，使其散出花粉，將濾液過濾至離心管，蓋緊蓋子并用封口膜封好管口再離心。

2.2.4 離心和分裝

離心2～3次，每次離心后都要在超凈工作臺上用75%醫(yī)用酒精擦拭雙手和離心管外壁。離心后棄上清液，倒入適量培養(yǎng)基，懸浮后分裝于培養(yǎng)皿內(nèi)。分裝時管口要在酒精燈上滅菌，吸取添加物前對吸管口也要滅菌。分裝后，用封口膜把培養(yǎng)皿封嚴(yán)，阻斷內(nèi)外空氣對流，避免污染。

2.3 接種后

保持培養(yǎng)箱清潔，用75%醫(yī)用酒精擦拭內(nèi)壁，設(shè)定好溫度和濕度。注意濕度的設(shè)定，濕度大了易造成污染，濕度小了空氣干燥，封口膜易裂開造成污染。

3 其它防治對策

NLN培養(yǎng)基中應(yīng)加入一定濃度的抗生素或殺菌劑，以防內(nèi)生菌污染，NLN培養(yǎng)基常溫下過濾除菌后，不會造成抗生素或殺菌劑的分解，但要通過試驗篩選出抗生素或殺菌劑的最佳使用濃度?？刂莆廴?、建立潔凈培養(yǎng)環(huán)境、無菌的植株系統(tǒng)是組培育苗成功的三要素[19]。