李偉，胡可勝，鄧小鳳

(武警廣東省總隊(duì)醫(yī)院，廣州510507)

胰島素抵抗是妊娠期糖尿病的發(fā)病機(jī)制之一，改善胰島素信號傳導(dǎo)可有助于預(yù)后。微小RNA(miRNA)是一類核苷酸長度為18～23 nt的單鏈非編碼RNA，通過結(jié)合3′非翻譯序列影響mRNA的穩(wěn)定和(或)翻譯而發(fā)揮轉(zhuǎn)錄后修飾作用。據(jù)估計(jì)，miRNA約占有核生物基因組的1%，并且靶基因調(diào)節(jié)范圍達(dá)全部基因的30%[1]。近年來研究發(fā)現(xiàn)，miRNA可通過調(diào)節(jié)胰島素合成、分泌、信號轉(zhuǎn)導(dǎo)而在糖尿病的發(fā)病中起重要作用[2]。前期對妊娠期糖尿病婦女胎盤組織中miRNA的差異表達(dá)譜進(jìn)行了探討，發(fā)現(xiàn)有100多種miRNA在妊娠期糖尿病患者胎盤組織中高表達(dá)，miR-372-3p是其中之一[3]。生物信息學(xué)分析提示差異表達(dá)的miRNA調(diào)控的靶基因有胰島素信號通路相關(guān)因子。2016年12月～2017年4月，本研究探討降低miR-372-3p表達(dá)對胰島素抵抗細(xì)胞糖代謝的影響及機(jī)制，闡明miR-372-3在胰島素信號通路的調(diào)節(jié)靶點(diǎn)。

1 材料與方法

1.1 材料 人肝癌細(xì)胞系HepG2、DMEM培養(yǎng)基、TRIzol試劑購自廣州吉妮歐生物公司；胎牛血清購自賽齊(上海)生物工程有限公司；BCA蛋白定量試劑盒購自Thermo公司；葡萄糖試劑盒購自上海榮盛生物技術(shù)公司；β-actin抗體購自Thermo公司；PI3K p85和GLUT4抗體購自abcam公司；二抗羊抗兔IgG(H+L)購自Bioworld Technology公司。根據(jù)miRBase中提供的miR-372序列，設(shè)計(jì)擴(kuò)增的引物和反義寡核苷酸序列，引物、miR-372-3p反義寡核苷酸(miR-372-3p ASO)和陰性對照物(NC ASO)由上海意果科技公司合成。

1.2 胰島素抵抗細(xì)胞模型構(gòu)建 用高糖培養(yǎng)法。HepG2細(xì)胞按常規(guī)方法培養(yǎng)，用含10%胎牛血清的RPMI1640培養(yǎng)液在5% CO2、37 ℃、飽和濕度條件下培養(yǎng)，每日換液，用0.25%胰蛋白酶進(jìn)行消化，按1∶3比例傳代培養(yǎng)，取對數(shù)生長期的細(xì)胞用于實(shí)驗(yàn)。將HepG2細(xì)胞隨機(jī)分為胰島素抵抗組及正常對照組。制備好的HepG2細(xì)胞懸液用PBS 洗滌2次，然后按3×105/孔接種于6孔細(xì)胞培養(yǎng)板中。胰島素抵抗組每孔加入含25 mmol/L人葡萄糖無血清無酚紅培養(yǎng)液2 mL，對照組加入普通含糖量(6 mmol/L)的無血清無酚紅培養(yǎng)液，繼續(xù)培養(yǎng)16 h。

1.3 細(xì)胞內(nèi)miR-372-3p表達(dá)檢測 采用RT-PCR法。用TRIzol法提取各組細(xì)胞總RNA，加入無RNA酶50 μL水溶解RNA，取樣品1 μL用分光光度計(jì)測量RNA濃度，RNA溶液于-80 ℃冷凍保存?zhèn)溆?。取總RNA 2 μg，按試劑盒進(jìn)行加尾操作，1 h后取尾后的樣本進(jìn)行反轉(zhuǎn)錄合成miR-372-3p單鏈cDNA。用TaqMan microRNA探針和ABI7500熒光定量PCR儀進(jìn)行逆轉(zhuǎn)錄和PCR擴(kuò)增。PCR反應(yīng)條件：95 ℃ 5 min，95 ℃ 15 s、60 ℃ 1 min進(jìn)行45個(gè)循環(huán)。以 U6 snRNA做內(nèi)參。用2-ΔΔCt法計(jì)算目標(biāo)基因相對表達(dá)量。

1.4 miR-372-3p靶基因預(yù)測 用Mireap軟件進(jìn)行靶基因預(yù)測。miRNA的靶基因預(yù)測規(guī)則：小RNA與靶基因間的錯(cuò)配不得超過4個(gè)(G-U配對認(rèn)為0.5個(gè)錯(cuò)配)；在miRNA/靶基因復(fù)合體相鄰位點(diǎn)的錯(cuò)配不得超過2處；在miRNA/靶基因復(fù)合體中，從miRNA的5′端起第2～12個(gè)位點(diǎn)相鄰位點(diǎn)不得都發(fā)生錯(cuò)配；miRNA/靶基因復(fù)合體的第10～11個(gè)位點(diǎn)不得發(fā)生錯(cuò)配；在miRNA/靶基因復(fù)合體中，從miRNA的5′端起第1～12個(gè)位點(diǎn)錯(cuò)配不得超過2.5個(gè)；miRNA/靶基因復(fù)合體的最低自由能(MFE)應(yīng)不小于該miRNA與其最佳互補(bǔ)體結(jié)合時(shí)MFE的75%。

1.5 胰島素抵抗細(xì)胞轉(zhuǎn)染 胰島素抵抗HepG2細(xì)胞在6孔板中培養(yǎng)，1×106/孔。隨機(jī)分為hsa-miR-372-3p ASO組、NC ASO組，24 h后，采用脂質(zhì)體轉(zhuǎn)染試劑Lipofectamine 2000將100 nmol/L的hsa-miR-372-3p ASO、NC ASO分別轉(zhuǎn)染至hsa-miR-372-3p ASO組、NC ASO組，每組設(shè)6孔。

1.6 胰島素抵抗細(xì)胞內(nèi)PI3K、GLUT4蛋白表達(dá)檢測 采用Western blotting法。轉(zhuǎn)染48 h后，于4 ℃下收集細(xì)胞，每孔加入細(xì)胞裂解液100 μL(50 mmol/L Tris-HCl、150 mmol/L NaCl、5 mmol/L pH 8.0 EDTA、1% NP40、0.05% PMSF、2 μg/mL Aprotinin、0.15 μg/mL Leupeptin)，超聲破碎，4 ℃ 12 000 r/min離心5 min，收集上清液。紫外分光光度儀測定蛋白質(zhì)濃度。取提取物(含50 μg蛋白)，采用3%濃縮膠、12%分離膠SDS聚丙烯酰胺凝膠電泳，然后電轉(zhuǎn)染至纖維素膜。纖維素膜用含有5%脫脂奶的TBS封閉1.5 h，一抗(兔抗人pi3k 1∶500、兔抗人GLUT4 1∶1 000)4 ℃孵育過夜，倒去一抗，搖床上TBST洗2次，每次10 min，再用TBS洗10 min。加入辣根過氧化物酶鏈接的二抗羊抗兔 IgG(H+L)，于28 ℃搖床上孵育1.5 h。倒去二抗后用TBST洗滌4次，每次5 min。將膜裝入塑料袋，加入ECL試劑，暗室曝光、顯影、定影，以β-actin作為內(nèi)參分析結(jié)果。以目的蛋白和內(nèi)參蛋白灰度值比值作為目的蛋白的相對表達(dá)量。

1.7 胰島素抵抗細(xì)胞葡萄糖消耗檢測 采用葡萄糖過氧化物酶法。將胰島素抵抗細(xì)胞隨機(jī)分為陰性對照組、miR-372-3p ASO抑制組和二甲雙胍處理組(加入1 μmol/L二甲雙胍)，各培養(yǎng)10 h。根據(jù)葡萄糖檢測試劑盒說明書進(jìn)行操作，計(jì)算培養(yǎng)液中葡萄糖含量。培養(yǎng)液中葡萄糖含量=樣品吸光度值/標(biāo)準(zhǔn)管吸光度值×標(biāo)準(zhǔn)品濃度(g/L)×1 L/g蛋白。

2 結(jié)果

2.1 胰島素抵抗細(xì)胞中miR-372-3p的表達(dá)水平及靶基因 胰島素抵抗組miR-372-3p相對表達(dá)量為2.39±0.57、對照組為1.23±0.34。胰島素抵抗組miR-372-3p相對表達(dá)量高于對照組(P<0.05)。Mireap分析顯示miR-372-3p的靶基因有PI3K調(diào)節(jié)亞單位β、GLUT4、PKA和MAPK等。

2.2 miR-372-3p低表達(dá)對胰島素抵抗細(xì)胞內(nèi)PI3K、GLUT4蛋白表達(dá)的影響 miR-372-3p ASO抑制組PI3K、GLUT4蛋白相對表達(dá)量(1.79±0.17、1.52±0.25)均較NC ASO組(1.35±0.18、0.73±0.13)高(P均<0.05)。

2.3 miR-372-3p對胰島素抵抗細(xì)胞糖代謝的影響 miR-372-3p ASO抑制組體外細(xì)胞葡萄糖消耗(0.77±0.09)較陰性對照組(0.41±0.06)高(P<0.05)；較二甲雙胍處理組(0.86±0.05)低，但差異無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P>0.05)。

3 討論

胰島素信號傳導(dǎo)障礙是胰島素抵抗的重要因素[4]。以往研究顯示妊娠期糖尿病胰島素抵抗明顯升高，胰島素信號通路相關(guān)蛋白表達(dá)異常[5]。前期我們對妊娠期糖尿病產(chǎn)婦胎盤組織中miRNA表達(dá)譜進(jìn)行探索，發(fā)現(xiàn)調(diào)節(jié)胰島素信號通路的許多miRNA差異表達(dá)[3]。提示妊娠期糖尿病的發(fā)病機(jī)制與miRNA在胰島素信號通路調(diào)節(jié)作用有關(guān)。本研究發(fā)現(xiàn)，HepG2胰島素抵抗細(xì)胞內(nèi)miR-372-3p表達(dá)升高，靶基因預(yù)測顯示miR-372-3p與胰島素信號通路相關(guān)。miR-372是定位于19號染色體的mir-371-372基因簇的產(chǎn)物。血糖控制良好與控制差的患者血液中miR-372-3p表達(dá)有明顯差異，miR-372-3p是2型糖尿病發(fā)病的危險(xiǎn)因素之一[6]。

胰島素信號通路蛋白PI3K和GLUT-4在糖代謝中起重要作用，并被預(yù)測為miR-372-3p的靶基因。胰島素信號的激活包括胰島素結(jié)合胰島素受體(IR)、產(chǎn)生細(xì)胞質(zhì)的受體酪氨酸殘基自體磷酸化和胰島素受體底物(IRS)的酪氨酸磷酸化。這使得IRS與下游效應(yīng)子如PI3K相關(guān)聯(lián)[7]。PI3K蛋白是異二聚體脂酶，有調(diào)節(jié)(p85)和催化單元(p110)。靜息狀態(tài)下p85對p110起抑制作用，在胰島素刺激下IRS-1上特異的酪氨酸殘基可與p85亞基結(jié)合，進(jìn)而激活p110亞基，后者經(jīng)磷酸化PKB/AKT激活，進(jìn)一步使PKB的絲氨酸殘基磷酸化，導(dǎo)致GLUT4從胞內(nèi)易位至胞膜而促進(jìn)葡萄糖的利用[8]。PI3K作為胰島素信號轉(zhuǎn)導(dǎo)通路的焦點(diǎn)，表達(dá)減少或活性降低將導(dǎo)致胰島素信號轉(zhuǎn)導(dǎo)異常，發(fā)生胰島素抵抗。而GLUT4是胰島素作用下主要的葡萄糖轉(zhuǎn)運(yùn)蛋白。本研究結(jié)果顯示，體外細(xì)胞中miR-372-3p表達(dá)被抑制后，PI3K和GLUT-4表達(dá)升高，其分子機(jī)制可能是由于反義寡核苷酸解除了miR-372-3p對PI3K、GLUT-4的抑制作用，升高了PI3K和GLUT4蛋白表達(dá)。當(dāng)胰島素抵抗細(xì)胞轉(zhuǎn)染miR-372-3p ASO后，細(xì)胞葡萄糖消耗明顯高于NCASO轉(zhuǎn)染組，與二甲雙胍處理組無明顯差別，可能由于miR-372-3p ASO解除了靶基因?qū)σ葝u素信號通路蛋白表達(dá)的抑制作用，從而改善了胰島素抵抗。

綜上所述，miR-372-3p在胰島素抵抗細(xì)胞中高表達(dá)，降低miR-372-3p表達(dá)可促進(jìn)胰島素抵抗細(xì)胞糖代謝，其機(jī)制可能與miR-372-3p抑制PI3K、GLUT4表達(dá)有關(guān)。