任路平 于賢 王娜 劉娜 宋光耀 陳樹(shù)春

河北省人民醫(yī)院內(nèi)分泌科（石家莊 050000）

近年，人群中含果糖的軟飲料如可樂(lè)、果汁等的攝入量逐年增加，果糖對(duì)肝臟脂質(zhì)沉積的影響已逐漸被認(rèn)識(shí)。果糖主要在肝細(xì)胞內(nèi)代謝，我們的既往動(dòng)物研究證明高果糖飲食可引起脂肪肝，并且和肝內(nèi)質(zhì)網(wǎng)應(yīng)激有關(guān)［1-3］。激活轉(zhuǎn)錄因子4（ATF-4）是內(nèi)質(zhì)網(wǎng)應(yīng)激中非折疊蛋白反應(yīng)PERK-eIF2α-ATF-4通路的下游因子，已有研究發(fā)現(xiàn)ATF-4具有調(diào)節(jié)脂代謝的作用［4-5］，但目前國(guó)內(nèi)尚無(wú)研究觀察ATF-4在果糖致肝臟脂質(zhì)沉積中的作用，探討ATF-4對(duì)果糖所致肝脂質(zhì)沉積的作用有助于進(jìn)一步探索果糖對(duì)脂代謝的危害及內(nèi)質(zhì)網(wǎng)應(yīng)激在脂肪肝中的介導(dǎo)機(jī)制。故本研究通過(guò)敲低ATF-4在HepG2細(xì)胞的表達(dá)，探討果糖致HepG2細(xì)胞脂質(zhì)沉積中ATF-4的介導(dǎo)作用及可能機(jī)制。

1 材料與方法

1.1 細(xì)胞培養(yǎng)及轉(zhuǎn)染 人肝腫瘤系HepG2細(xì)胞（江蘇省江陰康眾康民生物醫(yī)藥技術(shù)有限公司，批號(hào)：HUCL-0085）用含10%FBS，1%NEAA的MEM培養(yǎng)液于37℃含5%CO2的溫箱中培養(yǎng)，待細(xì)胞80%生長(zhǎng)融合。將處于對(duì)數(shù)生長(zhǎng)期的細(xì)胞消化后，用含10%FBS，1%NEAA的MEM培養(yǎng)液調(diào)整細(xì)胞密度為106個(gè)/L，轉(zhuǎn)入孔板中，將ATF小干擾RNA（SiRNA）（Santa Cruz，CA，USA）轉(zhuǎn)染致HepG2細(xì)胞。

1.2 細(xì)胞分組 根據(jù)不同處理將細(xì)胞分為正常對(duì)照組（C組，普通培養(yǎng)基培養(yǎng)HepG2細(xì)胞組）；高果糖組（F組，含20 mmol/L果糖的培養(yǎng)基培養(yǎng)的HepG2細(xì)胞組）；高果糖+陰性對(duì)照組（F+NC組，含20 mmol/L果糖的培養(yǎng)基培養(yǎng)的HepG2細(xì)胞轉(zhuǎn)染空白對(duì)照質(zhì)粒組）；高果糖+ATF-4 siRNA組（F+ATF-4 siRNA組，含20 mmol/L果糖的培養(yǎng)基培養(yǎng)的HepG2細(xì)胞轉(zhuǎn)染ATF-4 siRNA組）。

x代表基帶信號(hào)，M代表幾進(jìn)制調(diào)制，本文的M取2和4。調(diào)制信號(hào)產(chǎn)生以后，再給調(diào)制信號(hào)加上高斯噪聲，模仿信號(hào)傳輸過(guò)程中的干擾。把調(diào)制信號(hào)加上高斯噪聲的函數(shù)如下：

1.3 HepG2細(xì)胞甘油三酯測(cè)定 收集細(xì)胞，制備細(xì)胞懸液，將細(xì)胞懸液1 000 r/min，離心10 min，棄上清液，留細(xì)胞沉淀；按照甘油三酯測(cè)定試劑盒（普利萊基因技術(shù)有限公司）提供的操作方法，采用GPO-PAP法測(cè)定HepG2細(xì)胞內(nèi)甘油三酯含量。

1.6 HepG2細(xì)胞的蛋白表達(dá)測(cè)定 本實(shí)驗(yàn)應(yīng)用Western Blot方法測(cè)定了ATF-4及下游脂質(zhì)合成的關(guān)鍵酶類(lèi)脂肪酸合成酶（FAS）、乙酰輔酶A羧化酶（ACC）、硬脂酰CoA去飽和酶（SCD-1）的蛋白表達(dá)水平。提取HepG2細(xì)胞總蛋白，取50 μg蛋白進(jìn)行SDS-PAGE凝膠電泳，經(jīng)過(guò)轉(zhuǎn)膜、封閉，加入1∶1 000～1∶2 000稀釋的抗體，4℃搖床過(guò)夜，TTBS緩沖液洗膜后加入1∶10 000稀釋的辣根過(guò)氧化物酶標(biāo)記的山羊抗兔抗體孵育1 h，經(jīng)化學(xué)發(fā)光，顯影，定影及蛋白表達(dá)半定量分析。FAS抗體購(gòu)于Santa Cruz公司，SCD-1、ACC、ATF-4抗體購(gòu)于美國(guó)Cell Signal Technology公司，抗β-actin小鼠單克隆抗體購(gòu)于SAB公司。

2.1 轉(zhuǎn)染ATF-4 siRNA對(duì)ATF-4蛋白表達(dá)的影響 F組ATF-4表達(dá)較C組顯著升高（P＜0.01），提示果糖刺激引起HepG2細(xì)胞內(nèi)質(zhì)網(wǎng)應(yīng)激通路PERK-eIF2α-ATF-4的激活。F+ATF-4 siRNA組ATF-4的表達(dá)水平比F組顯著降低，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P＜0.01），說(shuō)明ATF-4表達(dá)水平被有效抑制（圖1）。