蘇曉芳 董航明 蔡紹曦

南方醫(yī)科大學南方醫(yī)院呼吸與危重癥醫(yī)學科，慢性氣道疾病實驗室（廣州 510515）

眾所周知，感染是許多慢性呼吸道疾病急性發(fā)作的重要因素，其中細菌感染占絕大多數［1］，部分與病毒性感染有關［2］。由于傳統(tǒng)培養(yǎng)技術是利用特定的培養(yǎng)基只能培養(yǎng)特定以及常見的病原體，使我們對呼吸道微生物的認識非常局限。過去的數十年里，人們一直認為健康人的下呼吸道是無菌的，且認為慢性呼吸道疾?。╟hronic respiratory disease，CRD）的急性發(fā)作主要是致病菌所致。隨著高通量測序技術的發(fā)展，尤其是二代測序技術在微生物組學研究的應用，發(fā)現健康人下呼吸道同樣存在微生物菌群，并且提出了真菌菌群平衡與失調的觀念。認為人類健康與疾病也同真菌菌群的動態(tài)變化密切相關［3］，而不僅僅是常見幾種包括流感嗜血桿菌、莫拉氏菌、肺炎鏈球菌、銅綠假單胞菌等病原菌［4］導致急性發(fā)作及病情進展。目前許多呼吸道微生物組學研究主要集中在細菌菌群，而對于真菌菌群以及病毒的研究都較為缺乏，尤其是真菌微生物組與CRD的相關研究。本文就真菌微生物組與慢性呼吸道疾病的關系及微生態(tài)平衡與失調、二代測序在真菌微生物組學中的應用做一綜述。

1 呼吸道真菌微生物組與慢性呼吸道疾病

真菌及真菌孢子可存在于人類的皮膚、黏膜、口腔、消化道、肺部等［5］，一些直徑＜2～3μm的真菌以及真菌孢子可被吸入至終末支氣管甚至是肺泡內。而真菌病原學特性與人體局部免疫反應則決定著這些微生物是附著/定植于或被清除出呼吸道，進而導致疾病的發(fā)生及進展［6-7］。真菌感染是威脅人類健康的一大疾病，尤其是肺部真菌感染，致死性高，嚴重威脅公共健康及患者生命。但是，真菌感染的診治有時卻讓人束手無策，目前最常見且臨床上能培養(yǎng)到的仍是念珠菌以及曲霉菌兩大類［8］。同時，已有研究不僅表明了真菌與CRD之間的關系，還發(fā)現呼吸道真菌與CRD預后有關，也可導致肺功能的減退［9］。更有研究發(fā)現使用廣譜抗生素影響真菌與細菌之間微生態(tài)平衡，導致呼吸道真菌感染的發(fā)生以及病原體對抗真菌藥產生耐藥［10］。臨床上面臨的種種挑戰(zhàn)，讓我們迫切需要一種新方法更準確、快速地輔助臨床診療。雖然傳統(tǒng)培養(yǎng)方法是真菌感染一種重要的診斷方法，但是它在鑒別混合感染以及分析菌群群落結構和動態(tài)變化非常有限。據我們所知，基于常規(guī)的培養(yǎng)方法，很多真菌或者未被發(fā)現的新菌種，很難甚至無法被培養(yǎng)出來［11］。二代測序技術無論從檢測深度及廣度，亦或分析菌群群落結構特征，明顯優(yōu)于培養(yǎng)技術。目前使用二代測序研究肺部真菌與CRD的關系并不多，過去的研究報道主要見于囊性纖維化（cystic fibrosis，CF）、哮喘以及慢性阻塞性肺疾?。╟hronic obstructive disease，COPD）等。有些研究也發(fā)現在健康人的下呼吸道可檢測到少量的真菌微生物存在，主要是一些條件致病菌如曲霉菌和枝孢菌屬；同時也發(fā)現健康人下呼吸道真菌微生物組與上呼吸道的有差別，如口咽部真菌菌群是以念珠菌屬為主［12］。

對于CRD患者呼吸道真菌菌群也明顯與健康人的不同，其中研究最多的是CF患者。利用培養(yǎng)技術很容易檢測到CF呼吸道定植真菌菌群，超過50%患者可找到曲霉菌及念珠菌［13］；但是它們在CF病情進展過程所起的作用存在爭議。有些研究發(fā)現，CF患者呼吸道真菌負荷量增加而菌群α多樣性是減少的，真菌可導致肺功能減退，這可能與疾病的嚴重程度相關，其中念珠菌屬與曲霉菌屬更是與CF的發(fā)病率密切相關［14］。近年來，少數研究利用二代測序技術，可檢測到更為豐富的真菌菌群。據統(tǒng)計，利用454FLX方法檢測到的真菌菌群，超過60%的種屬是培養(yǎng)技術無法檢測到［14］。即使目前各個研究結果有所差異，但共同一致的是念珠菌屬豐度是最高的［14-15］。真菌可導致肺功能減退，影響疾病預后，而測序技術有助于從群落整體結構了解氣道微生物的全貌以進一步輔助疾病的診療。

同樣地，研究也發(fā)現真菌與哮喘的嚴重程度關系密切［12］，重癥哮喘患者相對于輕度者、哮喘患者相對于健康人群、使用激素者相對于未使用激素者，呼吸道真菌負荷量增多［16］，其中曲霉菌的相對豐度最高。哮喘患者痰液中馬拉色菌屬，Psathyrella candolleana，Termitomyces clypeatus和Grifola sordulenta菌群豐度比健康對照組的高；而Eremothecium sinecaudum，Systenostrema alba，Cladosporium cladosporioides和Vanderwaltozyma polyspora在健康對照組更為常見［12］。事實上，除了曲霉菌可引起變態(tài)反應性疾病如哮喘、ABPA等［16］，有些真菌如馬拉色菌屬也被認為跟一些變態(tài)反應性疾病相關，如特發(fā)性皮炎和慢性鼻竇炎［18-19］。甚至也有研究發(fā)現腸道菌群可加重肺部炎癥，引起肺部變態(tài)反應性疾病［19-20］，如腸道念珠菌可在腸道產生PEG2酶到達肺部引起炎癥反應［21］。目前對于真菌與哮喘之間的關系以描述性研究為主，而呼吸道真菌在哮喘的急性發(fā)作及發(fā)病機制等方面的研究仍處于初始階段，有待于深入探討。

真菌微生物組學研究在COPD上較為少見。2015年有一項隊列研究［22］，采集了56個研究對象（HIV、HIV合并COPD患者以及非HIV人群）的誘導痰（induced sputa，IS）、口腔灌洗液（oral washes，OW）以及肺泡灌洗液（bronchoalveolar lavages，BAL）。研究發(fā)現，在HIV合并COPD患者，肺孢子菌異常高表達。同時也發(fā)現念珠菌屬在OW標本中更為豐富，而Ceriporia lacerata、Saccharomyces cerevisiae以及Penicillium brevicompactum則在BAL標本中更為常見。并且研究表明HIV合并COPD與HIV肺功能正常者菌群結構有所差異。在HIV合并COPD人群中，BAL中可發(fā)現12種真菌的豐度更高（Sebacina incrustans，Junghuhnia nitida，Pneumocystis jirovecii等），而Bullera setariae和Trametes hirsuta在HIV肺功能正常者菌群豐度較高?，F真菌微生物組學在COPD患者的研究比較缺乏，2015年該項隊列研究主要還是以HIV患者為研究對象，并沒有納入COPD非HIV患者。因此，真菌微生物組與COPD急性發(fā)作及疾病進展的關系需要做進一步研究。同時COPD患者用藥（如吸入激素、支氣管擴張劑、抗生素等）對呼吸道真菌群落的影響還未明確，該方面研究尚缺乏但臨床意義重大，值得進一步探索。

2 腸道真菌微生物組與慢性呼吸道疾病

腸道菌群與腸道外疾病的關聯研究越來越多，包括肺部疾病如哮喘、神經精神疾病如帕金森病、糖尿病、高血壓病、肥胖等［23］；近些年提出了腸-肺軸，講述了腸道菌群與呼吸道菌群的相互作用［24］以及對疾病的影響。而腸道真菌菌群與肺部疾病的相關研究目前也不乏少數。早期提出的衛(wèi)生學假說，認為嬰幼兒期對微生物病原體的接觸減少后，此后過敏性疾病的發(fā)病率將大大增高［25］。有研究表明在抗生素治療后或無菌小鼠模型上，過敏性疾病發(fā)病率增加，且發(fā)現與缺乏微生物免疫相關的Th2有所關聯［25］。但現在更多的研究是，關于腸道微生態(tài)平衡與失調跟疾病的關系，如炎癥性腸?。?7］、腸易激綜合征、哮喘、CF等。如腸道菌群失調可增加呼吸道過敏性疾病的急性發(fā)作次數，尤其是念珠菌屬減少而曲霉菌屬、Wallemia及Epicoccum增加［20］。也有研究發(fā)現，在新生兒期腸道念珠菌和Rodotorula與哮喘的發(fā)病率增加相關，但是該機制尚未明確［27］。實際上也有研究利用哮喘模型小鼠，抗真菌治療后腸道真菌菌群變異或者念珠菌屬移植腸道后，可加重呼吸道炎癥反應［19-20］；同時伴隨著嗜酸細胞、肥大細胞、IL-3、IL-5、IFNγ以及IgE水平增高［19］。其中一項研究表明，腸道念珠菌通過產生一種PEG2酶作用于肺部后影響巨噬細胞導致呼吸道過敏性疾病的急性發(fā)作及加重［21］。其實，腸道菌群通常也反映口腔菌群菌落結構，而同時口腔菌群又直接影響呼吸道菌群，也與宿主微生物免疫相關。因此，口腔菌群、呼吸道菌群以及腸道菌群相互影響、相互作用，三者的研究都不可或缺。綜上所述，腸道真菌菌群與呼吸道疾病的發(fā)生發(fā)展也有關聯，但其機制尚未明確，還需深入研究。

3 真菌菌群微生態(tài)平衡與失調

真菌在我們的生存環(huán)境中是無處不在的，它在物種進化史扮演著重要的角色［28］，與人類有著千絲萬縷的聯系，對機體免疫系統(tǒng)有著巨大影響［29］，而免疫系統(tǒng)則維持著細菌、真菌與宿主之間的互利共生、共同進化的平衡關系。微生態(tài)失調首先在腸道細菌菌群上提出的，甚至認為可能是一些疾病的病因。但現在更多地認可真菌菌群失調在人類疾病發(fā)生發(fā)展過程中也起著重要的作用。它有別于真菌感染［30］，可以說是真菌感染的誘因，也是真菌感染的結果，它描述的是真菌菌群的整體結構特征。而我們的免疫系統(tǒng)則可識別共生真菌及致病真菌［3］，形成了一道天然的黏膜免疫屏障抵御真菌感染［31］。酵母科下的酵母屬和念珠菌屬、曲霉菌屬、鐮孢屬、枝孢屬以及馬拉色菌屬歸于共生真菌，它們在一定條件下可導致疾病的發(fā)生，甚至在免疫功能缺陷者可引起菌血癥。其中一些共生真菌參與維持機體免疫穩(wěn)態(tài)，如布拉酵母菌，則可預防廣譜抗生素使用后艱難梭菌的感染以及減輕腹瀉癥狀［32］。其機制是酵母菌可產生蛋白酶和磷酸酶，從而使艱難梭菌和大腸桿菌產生的毒素失活，而且它可限制白色念珠菌和沙門氏菌［33］。因此，除外真菌感染，還有真菌失調在我們臨床診治上也同樣有著重要的作用，需要臨床醫(yī)護人員以及研究者的關注以及進一步探索。

4 二代測序與真菌微生物組學研究

二代測序技術在微生物組學應用越來越廣泛，測序技術主要包括了宏基因組學和菌群結構譜。其中，真菌菌群結構譜方法主要是通過對真菌ITS1（internal transcribed spacer）和ITS2基因片段進行擴增、測序、分析，也可以稱作ITS1/ITS2基因測序技術。

真菌不同于細菌的結構特征是真菌有一層厚厚的細胞壁，因此，細菌DNA提取方法并不一定適用于真菌。真菌有自己獨特的DNA提取和PCR擴增的方法，而且不同的真菌DNA檢測方法可能會產生不一樣的結果。雖然，全基因組測序鳥槍法產生偏差最小，但它所要求的測序深度要絕對足夠完成全部測序序列的檢測。利用該方法檢測人類糞便標本時，只能檢測識別到5種真菌，包含6.5×1011堿基［34］。而利用真菌特異性檢測方法，如ITS1/ITS2基因測序，可檢測到50～60個菌屬［35］。該真菌特異性檢測方法是對真菌rDNA的ITS1/ITS2基因進行擴增并測序分析。因為不同的PCR引物可以靶向不同的真菌ITS基因，所以它可以更好地對真菌菌群進行分類。而且測序所得到的真菌ITS基因序列可以通過現有的基因數據庫進行匹對，但對于新物種，則無法準確地確定種類［36］。在Gene-Bank平臺上，還有許多真菌ITS測序序列被定義為“unidentified fungus”。還有一點需要說明的是，對于不同菌屬，ITS基因測序方法的識別度會有所差異。對于念珠菌屬以及曲霉菌屬，ITS基因測序可以很好地識別它們的ITS基因序列，并且可在種水平區(qū)分出一些病原菌菌株［37］。而對于有些菌屬如Cladosporium（枝孢屬）則無法更好地分類出其在種水平的菌株。因此，應根據研究設計、研究對象以及研究目的，權衡利弊，選擇適合的真菌檢測方法。

5 總結

真菌在我們的生存環(huán)境是無處不在的，與人類健康和疾病狀態(tài)息息相關。真菌菌群的動態(tài)平衡則對于維持免疫穩(wěn)態(tài)起著重要作用，并形成一道天然的黏膜免疫屏障保護機體。真菌存在于皮膚、口腔、腸道、呼吸道等部位，一部分真菌在一定條件下可致病，甚至導致菌血癥。而真菌微生物組學在呼吸道疾病研究比較少，未來仍有很大探索空間。近年來，二代測序技術的發(fā)展，使呼吸道微生物組學研究成為一個焦點并且研究內容更為豐富和深入，為我們提供更為廣闊的研究視野以及研究前景，并在未來可能成為指導我們臨床疾病的診治的重要手段。

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