胡海利，李衛(wèi)東，邵子瑜，李輝，徐軍楊，宋旺生

(合肥市婦幼保健所，合肥230001)

高苯丙氨酸血癥(HPA)是一種由于苯丙氨酸代謝通路中相關(guān)酶結(jié)構(gòu)和功能缺陷導(dǎo)致的常染色體隱性遺傳病，超過90%的患兒由苯丙氨酸羥化酶(PAH)基因變異導(dǎo)致[1]。PAH基因變異約97%～99%為位點變異，1%～3%為大片段缺失重復(fù)變異[2]。目前PAH數(shù)據(jù)庫中共收錄567種變異，涵蓋全部外顯子和部分內(nèi)含子以及側(cè)翼序列。不同PAH基因變異對PAH活性的保留程度不同，因而患兒苯丙氨酸在體內(nèi)的貯積程度不同，由此導(dǎo)致從輕度HPA到經(jīng)典苯丙酮尿癥(PKU)的一系列臨床表現(xiàn)[1]。不同的國家、地區(qū)、種族HPA患者的PAH基因變異類型并不相同[3～5]。中國PAH基因變異攜帶率總體上呈"西高東低、北高南低"的趨勢[6,7]。安徽地跨長江、淮河兩大流域，人口基數(shù)大，近十幾年來新生兒疾病篩查工作取得了長足發(fā)展，HPA檢出率逐年增加，但是缺乏安徽地區(qū)HPA患兒PAH基因變異情況的文獻(xiàn)資料。本研究對安徽省72例HPA患兒進(jìn)行PAH基因測序，分析PAH基因變異情況，并探討HPA患兒PAH基因變異情況與臨床表型的關(guān)系?，F(xiàn)報告如下。

1 資料與方法

1.1 臨床資料 72例患兒均為2012年1月～2017年1月在合肥市新生兒疾病篩查中心遺傳代謝病門診就診的戶籍為安徽省的HPA患兒，剔除PAH輔酶四氫生物蝶呤缺乏(BH4D)引起的苯丙氨酸增高。入組患兒男41例、女31例，年齡1～8歲。輕度HPA(血清苯丙氨酸120～<360 μmol/L)25例、輕度PKU(血清苯丙氨酸360～<1 200 μmol/L)18例、經(jīng)典PKU(血清苯丙氨酸≥1 200 μmol/L)29例。本研究已獲得醫(yī)院醫(yī)學(xué)倫理委員會批準(zhǔn)，患兒家長均知情同意并簽署知情同意書。

1.2 PAH基因測序方法 抽取患兒及父母靜脈全血3 mL，乙二胺四乙酸二鉀(EDTA2K)抗凝處理后，快遞至北京邁基諾醫(yī)學(xué)檢驗所，采用北京天根DP318-03分離試劑盒提取DNA，-20 ℃保存?zhèn)溆谩０邢蛲怙@子捕獲后進(jìn)行二代測序(NGS)，測序范圍包括13個外顯子和外顯子上下游200個堿基對的內(nèi)含子，對患兒及其父母PAH基因可疑變異位點進(jìn)行一代測序驗證，可疑大片段缺失重復(fù)進(jìn)行多重連接探針擴(kuò)增技術(shù)驗證。所有變異位點的篩選分析依據(jù)美國醫(yī)學(xué)遺傳學(xué)與基因組學(xué)學(xué)會(ACMG)2015指南[8]。

1.3 統(tǒng)計學(xué)方法 采用Excel和SPSS13.0統(tǒng)計軟件。

2 結(jié)果

2.1 72例安徽地區(qū)HPA患兒PAH基因變異情況 72例患兒144個PAH等位基因中共檢出140個位點變異(50種)，未發(fā)現(xiàn)大片段缺失重復(fù)。基因變異類型包括 31種錯義變異，9種剪接變異，3種終止變異，3種移碼變異，2種同義變異，2種缺失變異。變異位置涵蓋外顯子1～12及內(nèi)含子4、5、7、8、9、12，其中外顯子7變異最多，占21.43%(30/140)，其他位置的變異占比依次為外顯子2(14.29%，20/140)、外顯子11(14.29%，20/140)、外顯子6(10%，14/140)、外顯子12(9.29%,13/140)、外顯子3(7.86%，11/140)、外顯子5(6.43%，9/140)、內(nèi)含子4(5%，7/140)。變異頻率2%以上的變異類型由高至低依次為R243Q(18/140，12.86%)、R53H(17/140，12.14%)、Y204C(11/140，7.86%)、V399V(9/140，6.43%)、R241C(6/140，4.29%)、IVS4-1G>A(6/140，4.29%)、R111X(6/140，4.29%)、R413P(5/140，3.57%)、Y356X(4/140，2.86%)、A434D(3/140，2.14%)、R158W(3/140，2.14%)、Y166X(3/140，2.14%)。這些高頻變異占總變異的65%，其余變異為散發(fā)變異(2%以下)，未發(fā)現(xiàn)新發(fā)變異。

2.2 72例安徽地區(qū)HPA患兒PAH基因型及其與臨床表型的關(guān)系 72例患兒共檢出66種基因型。其中64例患兒檢出58種復(fù)合雜合變異基因型，R158W/V399V 、R53H/R111X 、Y204C/R241C 、Y204C/R243Q 、Y204C/V399V 基因型頻率最高，均為2例，其余基因型各1例；1例檢出1種純合變異基因型；6例患兒檢出5種單個基因變異基因型，其中R241C、R413P、R53H、Y356X基因型各1例，R243Q基因型 2例；2例患兒檢出2種三個以上基因變異(F161S +Y204C +IVS9+43G>T、R53H+IVS4-1G>A +IVS8+2T>A)。按照HPA臨床表型分組統(tǒng)計，29例經(jīng)典型PKU患兒共檢出29種變異類型、26種基因型，其中變異類型最常見的為R243Q、Y204C、V399V、R111X、IVS4-1G>A、R431P、G257V，依次占17.54%、17.04%、8.77%、7.02%、7.02%、3.51%、3.51%；基因型最常見的為R243Q、Y204C/R243Q、Y204C/V399V，均占6.9%。25例輕度HPA患兒共檢出30種變異類型、25種基因型，變異最常見的類型為R53H占32.65%，其次的R243Q、 D101N、V230I、R111X均占4.08%；基因型檢出2例R53H/R111X，其余均為1例。18例輕度PKU患兒共檢出18種變異類型、17種基因型，變異常見的為R243Q、R241C、Y204C、V399V、Y356X、R413P、R158W，依次占17.65%、14.71%、8.82%、8.82%、5.88%、5.88%、5.88%；基因型檢出2例R158W /V399V，其余基因型均1例。

3 討論

本研究對發(fā)現(xiàn)這72例HPA患兒PAH基因變異主要集中在外顯子2、3、5、6、7、11、12和內(nèi)含子4(共占88.57%)，變異類型主要為錯義變異，占67.86%，常見變異為R243Q、R53H、Y204C、V399V、 R241C、IVS4-1G>A、R111X、R413P、Y356X、A434D、R158W、Y166X，占65%，其中R243Q、R53H、Y204C、V399V占39.29%，與Li 等[6]報道的全國HPA患兒PAH基因變異情況基本一致，更接近于南方人群。表明安徽地區(qū)HPA患兒PAH基因變異熱點及變異類型與全國人群基本一致，未見明顯差異。

本研究發(fā)現(xiàn)17例患兒攜帶R53H變異，其中輕度HPA患兒16例，經(jīng)典PKU患兒1例(R53H+IVS4-1G>A/IVS8+2T>A)，經(jīng)檢索外顯子集成聯(lián)合(ExAC)數(shù)據(jù)發(fā)現(xiàn)1例R53H純合子的東亞健康人，表明R53H變異對PAH酶活性影響較小，與R53H體外酶活性研究相符[9]。17例患兒攜帶R243Q變異，包括經(jīng)典型PKU患兒 10例、輕度PKU患兒 5例、輕度HPA患兒 2例，表明R243Q變異對PAH酶活性影響非常大，與之前研究相符[3,9]。11例患兒攜帶Y204C，包括經(jīng)典型PKU患兒 8例、輕度PKU患兒 3例，表明Y204C變異對PAH酶活性影響大，然而PAH體外酶活性實驗結(jié)果顯示Y204C變異保留PAH酶活性的94%[10]，Ellingsen等[11]發(fā)現(xiàn)PAH 基因Y204C變異導(dǎo)致的結(jié)果是外顯子696A>G，因此，clinvar數(shù)據(jù)庫給出的PAH c.661A>G的變異結(jié)果是不正確的，所以對于數(shù)據(jù)庫給出的結(jié)果要辯證的采用。9例患兒攜帶V399V變異，其中經(jīng)典型PKU 患兒5例、輕度PKU患兒 3例、輕度HPA患兒 1例，表明V399V變異對PAH酶活性影響較重，Chao等[12]發(fā)現(xiàn)V399V變異導(dǎo)致外顯子11跳躍，與本研究結(jié)果相符。

本研究中共檢出2例患兒攜帶3個以上的PAH基因變異，即R53H+IVS4-1G>A /IVS8+2T>A(經(jīng)典PKU)、F161S/Y204C+IVS9+43G>T(輕度PKU)，并且檢測其父母樣本發(fā)現(xiàn)一方攜帶兩個變異，因此筆者認(rèn)為確定HPA患兒PAH基因突變類型需綜合考慮患兒和父母的PAH基因測序結(jié)果。此外，本研究1例輕度HPA患兒基因型為Y204C/R243Q(已做父母驗證)，由于Y204C、R243Q變異對PAH酶活性影響都很重 ，表明尚有未知的因素影響患兒的表型。本研究患兒PAH基因變異檢出率不足100%，表明目前的基因測序方法仍然存在一定的假陰性。究其原因，一可能是存在側(cè)翼序列和深度內(nèi)含子變異而NGS或者一代測序不覆蓋此區(qū)域；二是存在大片段的缺失重復(fù)，NGS存在假陰性而一代測序測序又不能檢出；三是存在大的插入缺失變異；四是存在其他未知的因素對PAH酶活性產(chǎn)生影響。因此，HPA的分型和診斷仍需要結(jié)合血清苯丙氨酸水平，不能完全依賴基因檢測結(jié)果。

隨著基因編輯技術(shù)CRISPR/Cas9技術(shù)的興起，遺傳病患兒治療的方法有了新的方向。Pan等[13]對攜帶PAH R408W的COS-7細(xì)胞進(jìn)行CRISPR/Cas9修正，結(jié)果PAH酶活性恢復(fù)正常。我們有理由相信，未來可以通過CRISPR/Cas9系統(tǒng)，對攜帶Y204C、V399V、R241C、IVS4-1G>A、R111X、R413P、Y356X、A434D、R158W、Y166X等高頻變異的患兒進(jìn)行基因治療，可能取得較大進(jìn)展。本研究結(jié)果為今后HPA患兒的表型診斷和基因治療提供了資料。綜合本研究結(jié)果，筆者認(rèn)為對HPA患兒PAH基因測序并確定變異類型，有助于預(yù)測患兒的臨床表現(xiàn)及預(yù)后情況，是HPA患兒診斷治療過程非常重要的一項工作。

[1] 葉軍, 顧學(xué)范. 高苯丙氨酸血的診治共識解讀[J]. 中華兒科雜志, 2014, 52(6): 430-432.

[2] Kozak L, Hrabincova E, Kintr J, et al. Identification and characterization of large deletions in the phenylalanine hydroxylase (PAH) gene by MLPA: evidence for both homologous and non-homologous mechanisms of rearrangement[J]. Mol Gen Metab, 2006,89(4):300-309.

[3] Okano Y, Kudo S, Nishi Y, et al. Molecular characterization of phenylketonuria and tetrahydrobiopterin-responsive phenylalanine hydroxylase deficiency in Japan[J]. J Hum Genet， 2011,56(4):306-312.

[4] 何江, 王惠珍, 徐發(fā)亮,等. 青海地區(qū)苯丙酮尿癥患者苯丙氨酸羥化酶基因突變分析[J]. 中國當(dāng)代兒科雜志, 2015, 17(11): 1221-1227.

[5] Purevsuren J, Bolormaa B, Narantsetseg C, et al. The first Mongolian cases of phenylketonuria in selective screening of inborn errors of metabolism[J]. Mol Genet Metab Rep, 2016,9(4):71-74.

[6] Li N, Jia H, Liu Z, et al. Molecular characterisation of phenylketonuria in a Chinese mainland p opulation using next-generation sequencing[J]. Sci Rep, 2015,5:15769.

[7] Zhu T, Qin S, Ye J, et al.Mutational spectrum of phenylketonuria in the Chinese Han population: a novel insight into the geographic distribution of the common mutations[J]. Pediatr Res, 2010,67(3):280-285.

[8] Richards S, Aziz N, Bale S, et al. Standards and guidelines for the interpretation of sequence variants: a joint consensus recommendation of the American College of Medical Genetics and Genomics and the Association for Molecular Pathology[J]. Genet Med, 2015,17(5):405-424.

[9] Kim S W, Jung J, Oh H J, et al. Structural and functional analyses of mutations of the human phenylalanine hydroxylase gene[J]. Clin Chim Acta, 2006,365(1-2):279-287.

[10] Trunzo R, Santacroce R, Shen N, et al. In vitro residual activity of phenylalanine hydroxylase variants and correlation with metabolic phenotypes in PKU[J]. Gene, 2016,594(1):138-143.

[11] Ellingsen S, Knappskog P M, Eiken H G. Phenylketonuria splice mutation (EXON6nt-96Ag) masquerading as missense mutation (Y204C)[J]. Hum Mutat, 1997, 9(1): 88.

[12] Chao HK, Hsiao KJ, Su TS. A silent mutation induces exon skipping in the phenylalanine hydroxylase gene in phenylketonuria[J]. Hum Genet, 2001,108(1):14-19.

[13] Pan Y, Shen N, Jung-Klawitter S, et al. CRISPR RNA-guided FokI nucleases repair a PAH variant in a phenylketonuria model[J]. Sci Rep, 2016,24(6):35794.