閆振富

(鄭州大學附屬鄭州中心醫(yī)院，鄭州450000)

冠狀動脈粥樣硬化性心臟病、慢性心力衰竭、高血壓等心血管疾病病死率和發(fā)病率較高，嚴重危害人類的健康。氧化應(yīng)激是誘導(dǎo)產(chǎn)生心血管疾病的重要原因之一[1]。機體在正常的狀態(tài)下，體內(nèi)氧自由基和活性氧(ROS)的產(chǎn)生及消除維持著動態(tài)平衡。而當機體受到有害刺激時，氧自由基、ROS等氧化產(chǎn)物的生成遠大于機體消除能力，從而損傷組織和細胞的抗氧化系統(tǒng)，導(dǎo)致細胞氧化應(yīng)激損傷。因此研究氧化應(yīng)激引起的心肌細胞凋亡可以有效改善心血管疾病的治療。研究證實，ROS可抑制心肌細胞增殖、誘導(dǎo)其凋亡或壞死，加重心血管病情[2]。過氧化氫(H2O2)是一種重要的ROS，氧化能力較強，常用于建造氧化應(yīng)激損傷模型。聚腺苷二磷酸核糖聚合酶(PARP)是一種多功能酶，主要作用是促進DNA修復(fù)、復(fù)制、轉(zhuǎn)錄調(diào)控和細胞分化等。研究表明PARP與心肌損傷或梗死等病理生理過程密切相關(guān)[3]。2014年6月～2016年10月本研究將siRNA-PARP轉(zhuǎn)染入H2O2損傷的人心肌細胞H9C2中，以探討PARP表達量降低對氧化應(yīng)激損傷心肌細胞增殖、凋亡的作用及機制。

1 材料與方法

1.1 主要材料 人心肌細胞H9C2、Eagle's Minimum Essential Medium(EMEM)培養(yǎng)基均購自美國American Type Culture Collection公司，胎牛血清(FBS)、Lipofectamine 2000轉(zhuǎn)染試劑盒均購自美國Invitrogen公司，細胞計數(shù)試劑盒(CCK-8)購自武漢默沙克生物科技有限公司，AnnexinV FITC細胞凋亡檢測試劑盒購自美國BD公司，BCA蛋白定量試劑盒購自上海碧云天生物技術(shù)研究所，蛋白激酶B(AKT)一抗、磷酸化AKT(pAKT)一抗、磷脂酰肌醇-3激酶(PI3K)一抗、磷酸化PI3K(pPI3K)一抗、甘油醛-3-磷酸脫氫酶(GAPDH)一抗、辣根過氧化物酶標記羊抗兔二抗購自美國Santa Cruz公司等。

1.2 細胞培養(yǎng)及模型建立 將人心肌細胞H9C2培養(yǎng)于EMEM培養(yǎng)基中，加入10% FBS、100 U/mL青霉素、100 mg/mL鏈霉素，保證培養(yǎng)環(huán)境無細菌污染，置于5% CO2、溫度37 ℃和濕度95%的細胞培養(yǎng)箱中培養(yǎng)。每天在倒置顯微鏡下觀察細胞的生長狀態(tài)，使用0、200 μmol/L H2O2混合氣體培養(yǎng)細胞48 h，建造氧化應(yīng)激模型。

1.3 細胞轉(zhuǎn)染及效果檢測 按照Lipofectamine 2000的說明書進行脂質(zhì)體轉(zhuǎn)染。取對數(shù)期細胞作為實驗對象，分為4組即對照組1、對照組2、陰性組、干擾組。轉(zhuǎn)染前1 d，調(diào)整細胞濃度，每孔1×105個細胞和2 mL培養(yǎng)基接種于6孔板中，置于5% CO2、37 ℃的細胞培養(yǎng)箱中培養(yǎng)24 h，待細胞融合度達到70%～80%左右進行轉(zhuǎn)染，加入5 μL脂質(zhì)體Lipofectamine 2000和100 μL無血清培養(yǎng)基，陰性組加入siRNA-NC，干擾組加入siRNA-PARP，對照組2、陰性組、干擾組細胞均為200 μmol/L H2O2刺激的細胞，對照組1為0 μmol/L H2O2刺激的細胞，室溫孵育20 min，放置培養(yǎng)箱中連續(xù)培養(yǎng)5 h后更換新鮮培養(yǎng)基繼續(xù)培養(yǎng)，24 h后Western blotting檢測轉(zhuǎn)染效果。

1.4 細胞增殖率檢測 采用CCK-8。取各組轉(zhuǎn)染后24 h細胞進行實驗，以每孔1×105個細胞接種于96孔板上，置于5% CO2、37 ℃的細胞培養(yǎng)箱中培養(yǎng)24 h。每組5個復(fù)孔，加入10 μL/孔CCK-8溶液，孵育2 h后置于酶標儀上測定450 nm波長下的吸光值。實驗重復(fù)3次。細胞增殖率=(對照組平均吸光值/實驗組平均吸光值)×100%。

1.5 細胞凋亡率檢測 采用流式細胞術(shù)。胰酶消化各組對數(shù)期細胞，1×Binding Buffer緩沖液將細胞密度調(diào)整為1×105個/mL，接種于6孔板中，待細胞融合度為70%～80%時，加入10 μL膜聯(lián)蛋白V-FITC和10 μL碘化丙啶，振蕩混勻，置于流式細胞儀上檢測細胞的凋亡率，每組5個復(fù)孔取平均數(shù)，實驗重復(fù)3次。

1.6 PI3K、pPI3K、AKT、pAKT蛋白表達量檢測 采用Western blotting法。收集各組細胞加入500 μL RIPA裂解液，充分混勻，置于冰上反應(yīng)30 min，4 ℃ 12 000 r/m離心10 min，取上清即為提取的總蛋白。根據(jù)BCA蛋白定量說明書檢測蛋白濃度。將提取的蛋白放入沸水中變性5 min。取50 μg蛋白樣品，使用10%的分離膠和5%的濃縮膠進行SDS-PAGE凝膠電泳至溴酚藍到達凝膠底部，然后進行轉(zhuǎn)膜70 min，在5%脫脂奶粉中室溫封閉2 h，剪取含有目的條帶和內(nèi)參GAPDH的條帶，分別加入一抗，4 ℃孵育過夜，TBST液漂洗，10 min×3次，加入二抗，37 ℃反應(yīng)2 h，TBST液漂洗，10 min×3次，加入ECL化學發(fā)光液，避光反應(yīng)10 min，分析蛋白質(zhì)的灰度值，以目的條帶灰度值與內(nèi)參GAPDH灰度值的比值為各目的蛋白的相對表達量。

2 結(jié)果

2.1 各組細胞轉(zhuǎn)染效果比較 對照組1、對照組2、陰性組、干擾組心肌細胞中PARP蛋白的表達量分別為0.213±0.026、0.585±0.064、0.561±0.062、0.383±0.032。與對照組1相比，對照組2、陰性組和干擾組細胞中PARP蛋白的表達量增加(P均<0.05); 與對照組2相比，陰性組心肌細胞中PARP蛋白的表達量差異無統(tǒng)計學意義(P>0.05)，但干擾組PARP蛋白的表達量降低(P<0.05)。

2.2 各組細胞增殖率比較 對照組1、對照組2、陰性組、干擾組心肌細胞的增殖率分別為100.000%±0.062%、62.143%±5.967%、60.148%±5.814%、83.452%±8.785%。與對照組1相比，對照組2、陰性組、干擾組心肌細胞的增殖率明顯降低(P均<0.05)；與對照組2相比，陰性組心肌細胞的增殖率差異無統(tǒng)計學意義(P>0.05)，但干擾組心肌細胞的增殖率升高(P<0.05)。

2.3 各組細胞凋亡率比較 對照組1、對照組2、陰性組、干擾組心肌細胞的凋亡率分別為8.421%±0.830%、27.573%±2.269%、28.205%±2.597%、15.648%±1.521%。與對照組1相比，對照組2、陰性組、干擾組心肌細胞的凋亡率明顯升高(P均<0.05)；與對照組2相比，陰性組心肌細胞的凋亡率差異無統(tǒng)計學意義(P>0.05)，但干擾組心肌細胞的凋亡率降低(P<0.05)。

2.4 各組PI3K、pPI3K、AKT、pAKT蛋白表達量比較 對照組1、對照組2、陰性組、干擾組心肌細胞中PI3K蛋白的表達量為0.785±0.082、0.386±0.031、0.362±0.035、0.512±0.053，pPI3K的表達量為0.712±0.075、0.322±0.034、0.331±0.026、0.523±0.049，AKT的表達量為0.878±0.072、0.461±0.044、0.442±0.042、0.626±0.057，pAKT的表達量為0.850±0.079、0.446±0.042、0.424±0.041、0.611±0.058。與對照組1相比，對照組2、陰性組、干擾組心肌細胞中PI3K、pPI3K、AKT、pAKT的表達量降低(P均<0.05)；與對照組2相比，陰性組心肌細胞中PI3K、pPI3K、AKT、pAKT表達量差異無統(tǒng)計學意義(P均>0.05)、干擾組心肌細胞中PI3K、pPI3K、AKT、pAKT的表達量增加(P均<0.05)。

3 討論

RNA干擾技術(shù)主要通過雙鏈RNA 引起同源轉(zhuǎn)錄因子降解，特異性阻礙其翻譯生成蛋白質(zhì)分子，從而沉默基因的現(xiàn)象。由于RNA干擾技術(shù)具有特異性、高效性等特點，廣泛應(yīng)用于疾病的基因治療、新藥開發(fā)、基因功能、神經(jīng)系統(tǒng)等的研究中，為癌癥的治療及遺傳病的研究提供了新的思路和方法。RNA干擾技術(shù)首次應(yīng)用于線蟲體內(nèi)，結(jié)果發(fā)現(xiàn)注入正義鏈和反義鏈的混合物比單獨注入單鏈RNA引起基因沉默的效果要強很多，且可沉默子一代同源基因。本研究通過siRNA靶向沉默H9C2心肌細胞PARP基因的表達，結(jié)果顯示，PARP基因的表達量顯著下降。

PARP屬于真核細胞中DNA修復(fù)酶之一，與DNA的損傷和修復(fù)有關(guān)，主要通過與細胞凋亡相關(guān)蛋白的結(jié)合調(diào)控細胞的凋亡過程。當細胞發(fā)生凋亡時，PARP不能與DNA片段結(jié)合，影響其損傷修復(fù)能力，導(dǎo)致DNA裂解，誘導(dǎo)細胞凋亡[4]。研究顯示，PARP在心肌損傷、慢性心力衰竭等心臟疾病的生理過程中發(fā)揮重要作用[5]。PARP在心肌損傷后被激活，存在于心臟疾病的整個病理生理改變過程中[6]。當細胞凋亡時，PARP被過度激活，耗盡細胞內(nèi)的能量物質(zhì)從而誘導(dǎo)細胞凋亡、損害機體[7]。ROS的過度積累導(dǎo)致細胞發(fā)生氧化應(yīng)激，是導(dǎo)致細胞凋亡、損傷的主要原因之一，在心血管疾病的發(fā)生、發(fā)展過程中起著重要作用。H2O2屬于ROS的一種，常被用來建造體外心肌細胞、神經(jīng)元等氧化應(yīng)激損傷模型。研究表明，以200 μmol/L H2O2可以降低心肌細胞50%的活力[8,9]。因此本實驗通過200 μmol/L H2O2刺激心肌細胞H9C2建造氧化應(yīng)激損傷模型，觀察PARP的表達量降低對心肌細胞損傷的保護作用。流式細胞術(shù)實驗結(jié)果表明H2O2可促進細胞凋亡，低表達的PARP可抑制氧化應(yīng)激引起的心肌細胞凋亡、促進其增殖。

細胞的凋亡過程受多條信號通路的調(diào)控。PI3K/AKT信號通路是一條絡(luò)氨酸激酶級聯(lián)信號傳導(dǎo)通路，主要通過影響下游靶基因的表達調(diào)控細胞的生長、分化、侵襲和促進血管生成、改善器官等[10]。近年來的研究表明機體細胞發(fā)生氧化應(yīng)激時，PI3K/AKT信號通路可誘導(dǎo)心臟、大腦等細胞發(fā)生凋亡[11]。AKT是PI3K重要的下游靶基因，AKT和磷酸肌醇依賴性蛋白激酶-1可與PI3K催化的3,4二磷酸磷脂酰肌醇結(jié)合，促使AKT磷酸化，調(diào)控下游凋亡蛋白的表達，參與細胞增殖、分化等生理過程。研究報道，pAKT可促使多種細胞凋亡相關(guān)基因的表達下降或失活，具有抑制細胞凋亡的作用，同時也可以減少氧化應(yīng)激誘導(dǎo)的細胞損傷。本研究中，H2O2刺激后導(dǎo)致心肌細胞增殖率降低、凋亡率增加，發(fā)生氧化應(yīng)激損傷；Western blotting檢測發(fā)現(xiàn)氧化應(yīng)激損傷的細胞內(nèi)PI3K、pPI3K、AKT和pAKT的表達量顯著下降，促進細胞凋亡的作用增強。沉默PARP表達緩解氧化應(yīng)激引起PI3K、pPI3K、AKT和pAKT的表達量降低，提示PARP可能是通過PI3K/AKT途徑，發(fā)揮改善H2O2抑制PI3K/AKT信號通路的作用。

綜上所述，H2O2刺激可使心肌細胞發(fā)生氧化應(yīng)激損傷，細胞的凋亡率增加、增殖率降低，但RNA干擾PARP表達能通過調(diào)控PI3K/AKT信號通路，抑制H2O2誘導(dǎo)的H9C2細胞凋亡，促進其增殖，有效保護心肌細胞。

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