陳東芹，姜敏，陶敏，陳龍邦

(1蘇州大學附屬第一醫(yī)院，江蘇蘇州215006；2南京軍區(qū)南京總醫(yī)院)

根據(jù)病理類型的不同，肺癌可分為小細胞肺癌和非小細胞肺癌，高達85%的肺癌為非小細胞肺癌，其中肺腺癌為非小細胞肺癌的主要病理類型[1，2]。多烯紫杉醇是治療肺腺癌的重要藥物,多用于肺腺癌術(shù)后輔助化療，但近年來多烯紫杉醇耐藥的發(fā)生率明顯提高。微小RNA-200b(miR-200b)是miR-200家族的重要成員。miR-200家族成員在多種腫瘤細胞和組織中呈顯著低表達，并發(fā)揮抑癌基因作用。我們前期利用高通量芯片技術(shù)分析了人肺腺癌親本細胞與耐藥細胞之間miRNAs表達差異，發(fā)現(xiàn)miR-200b在耐藥肺腺癌細胞中表達水平下調(diào)。組蛋白去乙?；?HDACs)通過移除組蛋白(或非組蛋白)賴氨酸殘基的乙酰基，形成相對封閉的染色質(zhì)構(gòu)象，抑制DNA的轉(zhuǎn)錄。我們前期研究發(fā)現(xiàn)下調(diào)組蛋白去乙?；?(HDAC1)表達后，miR-200b的表達明顯上調(diào)，提示HDAC1、miR-200b共同參與了體外培養(yǎng)的肺腺癌細胞耐藥。本研究觀察了肺腺癌組織HDAC1 mRNA、miR-200b表達變化，探討HDAC1 mRNA表達與患者預后的關(guān)系。

1 資料與方法

1.1 臨床資料 選擇2006年1月～2007年12月收治的肺腺癌患者72例。納入標準：①接受手術(shù)治療，有腫瘤組織標本留存。②術(shù)后病理證實為原發(fā)肺腺癌。③臨床分期為中晚期(Ⅲb～Ⅳ期)。④術(shù)后接受含多烯紫杉醇75 mg/m2的化療方案化療3個周期。納入患者男51例、女21例，年齡45～71歲，平均62歲，Ⅲb期25例、Ⅳ期47例?；熗瓿珊缶蠧T檢查，按RECIST標準評價療效，分為完全緩解(CR)、部分緩解(PR)、穩(wěn)定(SD)、進展(PD)，CR、PR為對多烯紫杉醇敏感。本組患者對多烯紫杉醇敏感32例(敏感組)，不敏感40例(不敏感組)。

1.2 癌組織HDAC1 mRNA、miR-200b檢測 收集兩組患者留存的腫瘤組織標本，用TRIzol法提取總RNA，逆轉(zhuǎn)錄為cDNA。采用實時熒光定量PCR法檢測HDAC1 mRNA、miR-200b表達。①HDAC1 mRNA：以GAPDH為內(nèi)參照。HDAC1 mRNA正向引物5′-TAACCTGCCTATGCTGATGCT-3′,反向引物5′-CTCATTCGTGTTCTGGTTAGTCATA-3′；GAPDH正向引物5′-TGGGTGTGAACCATGAGAAGT-3′，反向引物5′-TGAGTCCTTCCACGATACCAA-3′。PCR反應條件：95 ℃預變性2 min,95 ℃ 15 s、60 ℃ 40 s，共進行35個循環(huán)。②miR-200b：以U6位內(nèi)參照。miR-200b正向引物5′-GTGGAGGGTCCGAGGTATTC-3′，反向引物5′-CGTAATACTGCCTGGTAATGATG-3′；U6正向引物5′-CTCGCTTCGGCAGCACA-3′，反向引物5′-AACGCTTCACGAATTTGCGT-3′。PCR反應條件：95 ℃預變性30 s，95 ℃ 5 s、60 ℃ 31 s，共進行40個循環(huán)。以2-ΔΔCt表示HDAC1 mRNA、miR-200b相對表達量。 繪制肺腺癌組織HDAC1 mRNA、miR-200b相對表達量預測多烯紫杉醇敏感性的受試者工作特征(ROC)曲線，用最大約登指數(shù)法確定截斷值。HDAC1 mRNA、miR-200b相對表達量大于或等于截斷值定為高表達，否則為低表達。

1.3 HDAC1 mRNA與miR-200b表達的相關(guān)性 采用Spearman法分析HDAC1 mRNA與miR-200b表達的相關(guān)性。

1.4 HDAC1 mRNA、miR-200b高表達和低表達者1年無進展生存率 采用Kaplan-Meier法和Log-Rank檢驗比較HDAC1 mRNA、miR-200b高表達和低表達者1年無進展生存率。

2 結(jié)果

2.1 兩組HDAC1 mRNA、miR-200b相對表達量比較 敏感組、不敏感組HDAC1 mRNA相對表達量分別為0.76±0.12、1.23±0.35， miR-200b相對表達量分別為1.25±0.30、0.80±0.14，兩組相比P均<0.05。癌組織HDAC1 mRNA預測多烯紫杉醇敏感性的ROC曲線下面積為0.681，截斷值為0.86；癌組織miR-200b預測多烯紫杉醇敏感性的ROC曲線下面積為0.773，截斷值為0.79。72例患者HDAC1 mRNA高表達26例、低表達46例，miR-200b高表達41例、低表達31例。

2.2 癌組織HDAC1 mRNA表達與miR-200b表達的相關(guān)性 72例患者癌組織HDAC1 mRNA表達與miR-200b表達呈負相關(guān)(r=-0.791,P<0.05)。

2.3 HDAC1 mRNA、miR-200b高表達和低表達患者的無進展生存率比較 HDAC1高、低表達者1年無進展生存率分別為23.07%(6/26)、60.86%(28/46)，P<0.05。miR-200b高、低表達者1年無進展生存率分別為65.85%(27/41)、22.58%(7/31)，P<0.05。

3 討論

miRNAs是一類廣泛存在的長度為20～22個核苷酸的短鏈RNA，是轉(zhuǎn)錄后調(diào)控網(wǎng)絡中重要的調(diào)控因子，通過與靶基因mRNA 的3′-非翻譯區(qū)(3′-UTR)結(jié)合，從而導致翻譯抑制或脫腺苷酸化誘導的mRNA降解，從而在轉(zhuǎn)錄后水平調(diào)控靶基因的表達。據(jù)估計，大約有一半以上的人類蛋白編碼基因受到miRNAs的調(diào)控。大量研究表明，miRNAs不但維持著細胞正常生理功能，如細胞增殖、分化、凋亡等生物學過程，而且其表達紊亂也參與了多種病理生理過程，如腫瘤的發(fā)生、發(fā)展、遷徙、轉(zhuǎn)移、化療抵抗等[3，4]。miR-200b是miR-200家族的重要成員之一，該家族包括miR-200a、miR-200b、miR-200c、miR-141和miR-429共5個成員，依據(jù)定位不同可分為miR-200b/miR-200a/miR-429和miR-200c/miR-141兩個基因簇，分別定位于染色體1p36.33和12p13.31位點。miR-200家族成員在多種腫瘤細胞和組織中呈現(xiàn)顯著的低表達，并發(fā)揮抑癌基因作用，包括非小細胞肺癌、卵巢癌[5]、胃癌、乳腺癌、結(jié)直腸癌等[6～8]。我們前期利用高通量芯片技術(shù)分析了人肺腺癌親本細胞與耐藥細胞之間miRNAs表達差異，發(fā)現(xiàn)miR-200b在耐藥人肺腺癌細胞中表達顯著下調(diào)，上調(diào)miR-200b表達可顯著逆轉(zhuǎn)人肺腺癌細胞耐藥性。本研究結(jié)果顯示，不敏感組患者腫瘤組織miR-200b低于敏感組，與之前對人肺腺癌細胞的體外研究結(jié)果相符。表明miR-200b表達下降與肺腺癌患者的多烯紫杉醇耐藥有關(guān)。

本課題組前期研究發(fā)現(xiàn)，干擾HDAC1后人肺腺癌耐藥株中miR-200b的表達明顯上升，表明肺腺癌耐藥株中HDAC1與miR-200b是密切相關(guān)的，故本研究中筆者嘗試從組蛋白乙?；?去乙?；緩浇忉宮iR-200b表達下降參與肺腺癌DTX耐藥的機制。組蛋白乙?；?去乙?；緩降闹饕鞍资墙M蛋白乙酰化酶(HAT)和組蛋白去乙?；?HDACs)。HDACs通過移除組蛋白(或非組蛋白)賴氨酸殘基的乙酰基，形成相對封閉的染色質(zhì)構(gòu)象，抑制靶DNA的轉(zhuǎn)錄[9，10]。HDACs在多種腫瘤中高表達，在肺癌、乳腺癌、肝癌、結(jié)直腸癌、胃癌、前列腺癌患者中，高表達的HDACs與患者預后不良相關(guān)[11，12]。本研究結(jié)果顯示，不敏感組肺腺癌者腫瘤組織miR-200b表達高于敏感組，肺腺癌患者HDAC1 mRNA相對表達量與miR-200b相對表達量呈負相關(guān)，表明組蛋白乙?；?去乙?；緩絽⑴c了miR-200b表達下降參與肺腺癌多烯紫杉醇耐藥的機制，miR-200b表達下降可能會導致肺腺癌組織HDAC1表達升高，對靶基因轉(zhuǎn)錄的抑制作用減弱，靶基因轉(zhuǎn)錄水平升高而出現(xiàn)多烯紫杉醇耐藥，但具體是哪些靶基因參與了這一過程尚需進一步研究。本研究結(jié)果顯示，HDAC1低表達患者1年無進展生存率高于高表達者，miR-200b低表達患者1年無進展生存率低于低表達者，提示HDAC1高表達、miR-200b低表達肺腺癌患者的預后不良，可能原因是此類患者易出現(xiàn)DTX耐藥。

綜上所述，多烯紫杉醇不敏感的肺腺癌患者腫瘤組織HDAC1高表達、miR-200b低表達。檢測肺腺癌組織HDAC1、miR-200b表達有助于預測肺腺癌患者對多烯紫杉醇的敏感性和預后。

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