徐洪霞 薛剛

【摘要】目的：研究穗花杉雙黃酮在體外對人胃癌細胞MCC-803增殖抑制及凋亡的影響。方法：應(yīng)用MTT法檢測穗花杉雙黃酮對MGC-803細胞增殖的影響;應(yīng)用流式細胞儀檢測穗花杉雙黃酮對MGC-803細胞凋亡的影響;應(yīng)用Wes ternbolt檢測其對MCC-803細胞凋亡相關(guān)基因表達的影響。結(jié)果：穗花杉雙黃酮在對MGC-803細胞給藥24后，與空白組相比，能顯著MCC-803細胞的增殖，且這種抑制成濃度依賴關(guān)系。Annexin V/PI雙染法結(jié)果顯示穗花杉雙黃酮能誘導(dǎo)MCC-803細胞的凋亡，且呈現(xiàn)濃度依賴關(guān)系，Wes tern bolt結(jié)果顯示，穗花杉雙黃酮能上調(diào)Bax表達，下調(diào)Bcl-2表達。結(jié)論：穗花杉雙黃酮能有效抑制人胃癌細胞的增殖并誘導(dǎo)其凋亡;其機制可能是通過上調(diào)Bax表達，下調(diào)Bcl-2而實現(xiàn)。

【關(guān)鍵詞】穗花杉雙黃酮;MGC-803胃癌細胞;增殖;凋亡

胃癌是常見的消化道腫瘤之一，其死亡率在所有惡性腫瘤位居前列[1]。手術(shù)治療是目前治療胃癌的主要手段之一，配合化療效果更佳，然而臨床上目前常用的化療藥物具有較強的毒副作用，大多數(shù)患者身體狀況已不能耐受化療，因而越來越多的研究者講研究重點放在從天然產(chǎn)物中尋找具有抑制腫瘤細胞的惡性增殖、誘導(dǎo)分化和促進凋亡的藥物中。

石上柏又名卷柏、深綠卷柏、大葉菜等，具有清熱解毒、抗癌止血的功效。主要成分為生物堿類、黃酮類、甾醇、皂苷、氨基酸等成分[2]。藥理活性研究發(fā)現(xiàn)其中一種黃酮類穗花杉雙黃酮在體外有細胞毒活性，文獻報道其有較強的抗腫瘤作用，為此，本文對穗花杉雙黃酮作用于人胃癌細胞及其機制進行研究。

1 材料與方法

1.1 實驗材料

1.1.1 材料及試劑

穗花杉雙黃酮購買自中國藥品生物制品檢定所，用DMSO溶解，4℃保存，臨用前用完全培養(yǎng)基稀釋成所需濃度;1640培養(yǎng)基、小牛血清購買自美國Gibco公司;四甲基偶氮唑藍（MTT）試劑購自購買自Biosharp公司;Annexin-V/PI凋亡試劑盒購買自凱基公司，p-actin、Bax、Bcl-2 -抗購自美國santacruz公司，山羊抗鼠二抗、山羊抗兔二抗購買自北京中杉生物技術(shù)公司。

1.1.2 細胞株

人胃癌細胞株MGC-803細胞購自中研所，用含10%小牛血清以及1%雙抗的1640培養(yǎng)液，在5 %C02以及37℃環(huán)境下常規(guī)培養(yǎng)，取對數(shù)期生長期的細胞進行細胞實驗。

1.2 實驗方法

1.2.1 MTT法檢測穗花杉雙黃酮對人胃癌細胞MGC-803增殖的影響

取對數(shù)期生長的細胞作為實驗細胞，接種于96孔板，實驗組加入含穗花杉雙黃酮（濃度依次為400μmol/L，200μmol/L，lOOμmol/L，50μmol/L）的1640培養(yǎng)液以及含DMSO的1640培養(yǎng)液（濃度為1%。），設(shè)空白對照組，繼續(xù)培養(yǎng)24h后，MTT法染色，計算抑制率（1一實驗組/對照組），實驗重復(fù)3次。

1.2.2 Annexin-V/PI雙染法聯(lián)合流式細胞儀檢測穗花杉雙黃酮對人胃癌細胞MGC-803的凋亡比率

將MGC-803細胞接種于直徑為6cm的培養(yǎng)皿，設(shè)2個給藥組以及1個5 -FU陽性對照組，濃度分別為400μmol/L，200μmol/L，50μg/ml，以及1個空白對照組，繼續(xù)培養(yǎng)24h后，Annexin-V以及PI雙染色，用流式細胞儀檢測細胞凋亡。

1.2.3 Westem Bolt實驗

將細胞消化下來后，收集各濃度組相關(guān)蛋白，以Bradford法測得各濃度組蛋白濃度，取20μg蛋白上樣量檢測。經(jīng)SDSPAGE將蛋白分離后轉(zhuǎn)到PVDF膜上，隨后以5%脫脂奶粉溶液封閉PVDF膜th，一抗4℃過夜，次日二抗室溫孵育，PBST漂洗15min，使用ECL液進行發(fā)光和條帶分析。

1.3 統(tǒng)計學(xué)分析

采用SPSS19.O統(tǒng)計軟件進行分析，數(shù)據(jù)以（x±s）表示，各組之間比較采用t檢驗，以*為P<0.05為差異有統(tǒng)計學(xué)意義。2結(jié)果

2.1 穗花杉雙黃酮對人胃癌細胞MGC-803的增殖抑制

在不同濃度的穗花杉雙黃酮作用于MGC-803細胞24h后，與對照組相比，400μmol/L、200μmol/L濃度組對MGC-803細胞抑制率分別達到87.74%±4.3%，56.74%±9.3%，呈現(xiàn)濃度時間依賴關(guān)系（圖1）。

2.2 穗花杉雙黃酮對人胃癌細胞MGC-803凋亡的影響

流式細胞儀檢測結(jié)果顯示，穗花杉雙黃酮在作用于人胃癌細胞MGC-803 24h后，流式細胞儀檢測細胞早期凋亡結(jié)果示：隨著給藥濃度的增加，MGC-803細胞早期凋亡率從5.95%增加到19.18%、80.13%，5-FU陽參組早期凋亡為10.25% （P<0.05），與對照組相比具有統(tǒng)計學(xué)意義，并且隨著給藥濃度的增加各濃度組早期凋亡率呈上升趨勢，呈濃度依賴關(guān)系（圖2）。

2.3 穗花杉雙黃酮對MGC-803細胞凋亡相關(guān)基因表達的影響

Annexin-V/PI雙染法顯示穗花杉雙黃酮能誘導(dǎo)人胃癌細胞凋亡，繼而我們運用Westem Blot實驗進一步探討其誘導(dǎo)MGC-803細胞凋亡的分子機制。如圖所示（圖3），穗花杉雙黃酮作用于MGC-803細胞24h后，與對照組相比，給藥組Bax基因條帶隨著給藥濃度的上升其表達量明顯增高，Bcl-2基因條帶隨著給藥濃度的增加表達量減小，為此我們可得出結(jié)論，穗花杉雙黃酮其能上調(diào)人胃癌癌細胞MGC-803 Bax蛋白表達下調(diào)Bcl-2蛋白表達引起細胞凋亡。

3 討論

腫瘤細胞的無限增殖生長是惡性腫瘤的特征之一。研究表明，細胞凋亡在惡性腫瘤的發(fā)病機制中起著非常重要的作用[3]。細胞凋亡不是一個被動的過程，而是一個主動過程，它涉及到很多方面如基因的激活、表達以及調(diào)控等。Bcl-2家族蛋白是重要的細胞凋亡調(diào)節(jié)因子[4]。因此，研究Bcl-2家族對于探索新的腫瘤治療方法具有重要價值。

通過本實驗，我們得出以下結(jié)論：（1）穗花杉雙黃酮能和抑制人胃癌細胞MGC-803的增殖，且這種抑制呈現(xiàn)出時間濃度依賴關(guān)系; （2）穗花杉雙黃酮能夠誘導(dǎo)細胞細胞凋亡; （3）其誘導(dǎo)細胞凋亡機制為上調(diào)Bax的表達，下調(diào)Bcl-2蛋白表達。

參考文獻

[1]W Chen， RSZheng， et al. CancerStatistics in China， 2015 [J]. CACANCER J CLIN 2016， 66：115-132.

[2]孫麗娜.卷柏的化學(xué)成分及其藥理作用概述[J].遼寧中醫(yī)藥大學(xué)學(xué)報，2008，12： 193-184.

[3]馮群，夏嬙.基于細胞凋亡信號通路的抗菌肽抗腫瘤機制的研究進展[J].廣東醫(yī)學(xué)，2018，39 （03）：466-469.

[4]寇玉輝，張英俊，謝洪明，林興龍，許娟.Bcl-2蛋白及其相關(guān)藥物的研究進展[J].系統(tǒng)醫(yī)學(xué)，2018，3（13）：193—195.