張冬杰，張躍靈，王文濤，汪 亮，劉 娣

（黑龍江省農(nóng)業(yè)科學(xué)院畜牧研究所，農(nóng)業(yè)部種養(yǎng)結(jié)合重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室，黑龍江哈爾濱 150086）

通常情況下，由機(jī)體自身基因編碼、發(fā)揮消化功能的酶類消化能力均較弱，基本局限于對淀粉、蔗糖和乳糖的消化[1-2]。附植于消化道的微生物群落不是由宿主基因組編碼，但對機(jī)體日常飲食中大量復(fù)雜碳水化合物的消化起主要作用。人和動(dòng)物的消化道是由數(shù)以萬億的微生物細(xì)胞組成的多樣化生態(tài)系統(tǒng)[3-4]。二代高通量測序技術(shù)不再需要培養(yǎng)腸道微生物，即可對菌群進(jìn)行分類研究，因此，人類和各種動(dòng)物的腸道微生物菌群才得以深入分析。另外，生物信息學(xué)的飛速發(fā)展也為探索腸道微生物的分類及功能注釋提供了理論依據(jù)。目前，對腸道微生物的研究主要集中在腸道微生物與人類健康和疾病關(guān)系方面[5]，對豬、牛、羊、禽、小鼠等其他哺乳動(dòng)物的腸道微生物也開展了廣泛研究，采用方法多是采集新鮮糞樣，通過對16S rRNA變異區(qū)的測定分析菌群多樣性[6-8]。

民豬是黑龍江省唯一一個(gè)被列入國家畜禽遺傳資源保護(hù)名錄的地方豬種，也是華北型豬種的一個(gè)典型代表。民豬具有耐粗飼、抗逆、繁殖力高、肉質(zhì)優(yōu)良等優(yōu)點(diǎn)，但生長速度慢。目前即使飼喂相同飼糧，地方豬和引進(jìn)豬種在飼料利用率、生長速度、肉品質(zhì)等方面依舊存在著顯著的不同。可見，地方豬已經(jīng)形成了一種固化的、不同于引進(jìn)豬種的消化吸收系統(tǒng)。本研究擬通過對不同月齡民豬腸道微生物的比較分析，揭示民豬腸道微生物群落特征；通過在飼糧中添加粗纖維，分析粗纖維對民豬腸道微生物的影響，為后續(xù)深入研究民豬的耐粗飼特性提供理論依據(jù)。

1 材料與方法

1.1 試驗(yàn)材料 試驗(yàn)用豬均由黑龍江省農(nóng)業(yè)科學(xué)院畜牧研究所民豬保種場提供。試驗(yàn)共分3個(gè)處理組，成年組為5頭10月齡體重為（100±7.24）kg的民豬（M1～M5，成年母豬），青年組為5頭6月齡體重為（50±4.28）kg的民豬（MX1～MX5，青年母豬），青年粗纖維組為4頭6月齡體重為（50±4.34）kg的民豬（MX7～MX10，青年母豬）。成年組與青年組飼喂基礎(chǔ)日糧；青年粗纖維組在日糧中添加微貯玉米秸稈發(fā)酵物（粗纖維日糧），其他營養(yǎng)水平與基礎(chǔ)日糧相近。試驗(yàn)飼糧組成及營養(yǎng)成分見表1。飼喂30 d后，在同一時(shí)間點(diǎn)分別取100 g左右的新鮮糞樣，帶回實(shí)驗(yàn)室，立即使用糞便基因組提取試劑盒（天根生化科技（北京）有限公司，DP328）進(jìn)行基因組提取，1%瓊脂糖凝膠電泳檢測抽提基因組DNA，合格樣品-20℃保存?zhèn)溆谩?/p>

表1 日糧組成及營養(yǎng)成分

1.2 16SrRNA V4區(qū)的擴(kuò)增 選擇16S rRNA基因的V4區(qū)作為擴(kuò)增和測序的目的區(qū)間。首先合成兩端帶有標(biāo)簽的特異引物，擴(kuò)增16S rRNA的338～806 bp區(qū)間。引物序列：338F：5'-ACTCCTACGGGAGGCAGCAG-3'，806R：5'-GGACTACHVGGGTWTCTAAT-3'。 使 用TransStartFastpfu DNA 聚合酶和ABI公司的GeneAmp?9700型PCR儀進(jìn)行擴(kuò)增反應(yīng)。反應(yīng)體系：5×FastPfu Buffer 4 μL，2.5 mmol/LdNTPs 2 μL，F(xiàn)orward Primer（5 μmol/L）0.8 μL，Reverse Primer（5 μmol/L）0.8 μL，F(xiàn)astPfu Polymerase 0.4 μL，模板 DNA 10 ng，補(bǔ)去離子水至20 μL。PCR反應(yīng)條件：95℃3 min； 27個(gè)循環(huán)：95℃30 s，55℃30 s，72℃45 s；72℃10 min， 最 后10℃ 30 min。

1.3 樣品回收與測序 每個(gè)樣本3個(gè)重復(fù)，將同一樣本的PCR產(chǎn)物混合后用2%瓊脂糖凝膠電泳檢測，使用AxyPrepDNA凝膠回收試劑盒（AXYGEN公司）回收PCR產(chǎn)物，Tris-HCl洗脫；2%瓊脂糖電泳檢測。然后將樣本送交上海美吉生物有限公司進(jìn)行測序，測序平臺為IlluminaHiseq 2000。

1.4 數(shù)據(jù)優(yōu)化 Illumina平臺測序得到的是雙末端序列數(shù)據(jù)，首先根據(jù)讀序之間的相互重疊關(guān)系，將成對的讀序拼接成1條序列，同時(shí)對每條讀序的質(zhì)量以及拼接效果進(jìn)行質(zhì)控過濾，根據(jù)序列首尾兩端的條形碼和引物序列區(qū)分樣品，得到有效序列并校正序列方向。

1.5 OTU（Operational Taxonomic Units） 聚 類 分 析使用Usearch（Version 7.1）對質(zhì)控后的序列進(jìn)行OTU聚類分析。首先提取非重復(fù)序列，按照97%相似性對非重復(fù)序列（不含單序列）進(jìn)行OTU聚類，在聚類過程中去除嵌合體，得到OTU的代表序列，最后將所有優(yōu)化序列比對至OTU代表序列，選出與OTU代表序列相似性在97%以上的序列，生成OTU表格。

1.6 稀釋性曲線的制備 對所測得的序列進(jìn)行隨機(jī)抽樣，以抽到的序列數(shù)與它們所能代表OTU的數(shù)目構(gòu)建稀釋性曲線，當(dāng)曲線趨向平坦時(shí)，說明測序數(shù)據(jù)量合理，更多的數(shù)據(jù)量只會(huì)產(chǎn)生少量新的OTU，反之則表明繼續(xù)測序還可能產(chǎn)生較多新的OTU。本研究使用97%相似度的OTU，利用mothur做稀釋性曲線，利用R語言工具制作曲線圖。

1.7 基于Beta多樣性距離的非度量多維尺度分析 非度量多維尺度法（NMDS）是一種將多維空間的研究對象（樣本或變量）簡化到低維空間進(jìn)行定位、分析和歸類，同時(shí)又保留對象間原始關(guān)系的數(shù)據(jù)分析方法。適用于無法獲得研究對象間精確的相似性或相異性數(shù)據(jù)，僅能得到它們之間等級關(guān)系數(shù)據(jù)的情形。使用Qiime軟件計(jì)算Beta多樣性距離矩陣，Vegan軟件包作NMDS分析和作圖。

1.8 樣本相似度分析 根據(jù)Beta多樣性距離矩陣進(jìn)行層次聚類（Hierarchical Cluatering）分析 ，使用非加權(quán)組平均法UPGMA（UnweightedPair Group Method with Arithmetic Mean）算法構(gòu)建樹狀結(jié)構(gòu)，得到各個(gè)樣本間的樹狀關(guān)系圖。

1.9 多樣性指數(shù)及分類學(xué)分析 分別計(jì)算每個(gè)樣本的Ace和Shannon多樣性指數(shù)以及各樣本的覆蓋率。Ace（http://www.mothur.org/wiki/Ace）用來估計(jì)群落中OTU數(shù)目，是生態(tài)學(xué)中估計(jì)物種總數(shù)的常用指數(shù)之一；Shannon（http://www.mothur.org/wiki/Shannon）是用來估算樣品中微生物多樣性的指數(shù)之一，常用于反映Alpha多樣性指數(shù)，其值越大，說明群落多樣性越高。利用已有的16s細(xì)菌和古菌核糖體數(shù)據(jù)庫Silva以及ITS真菌數(shù)據(jù)庫Unite對獲得的每個(gè)OTU對應(yīng)的物種進(jìn)行分類，采用RDP classifier貝葉斯算法（置信度閾值為0.7）對97%相似水平的OTU代表序列進(jìn)行分類學(xué)分析，并在域、門、綱、目、科、屬、種7個(gè)水平上統(tǒng)計(jì)每個(gè)樣品的群落組成。選擇Silva（Release 123 http://www.arb-silva.de）和 Unite（Release 7.0 http://unite.ut.ee/index.php）作為參考基因組數(shù)據(jù)庫。

1.10 統(tǒng)計(jì)分析 使用SPSS16.0軟件中的t檢驗(yàn)對所獲得的數(shù)據(jù)進(jìn)行統(tǒng)計(jì)分析。

2 結(jié)果與分析

2.1 民豬腸道微生物DNA的提取及數(shù)據(jù)篩選 14個(gè)樣本均獲得了質(zhì)量良好的基因組DNA，同時(shí)也擴(kuò)增出了符合目的片段大小的PCR產(chǎn)物。測序完成后，對所測數(shù)據(jù)進(jìn)行質(zhì)控檢查。數(shù)據(jù)經(jīng)優(yōu)化整理后，每個(gè)處理組的數(shù)據(jù)統(tǒng)計(jì)結(jié)果見表2。各組間所獲得的序列條數(shù)及堿基個(gè)數(shù)經(jīng)統(tǒng)計(jì)學(xué)檢驗(yàn)均差異不顯著（P＞0.05）。

表2 樣本測序數(shù)據(jù)統(tǒng)計(jì)結(jié)果

97%相似度下樣品取樣深度的稀釋曲線見圖1，當(dāng)樣品隨機(jī)抽取的數(shù)據(jù)量為18 000左右時(shí)，曲線開始趨于平坦，表明取樣深度基本一致。3個(gè)處理組測序列長度均集中在441～460 bp（占69.97%）和421～440 bp（30.01%），每個(gè)處理組的平均長度同為440 bp。

2.2 民豬腸道微生物的OTU分析 對3個(gè)試驗(yàn)組共計(jì)14個(gè)樣本分別進(jìn)行OTU統(tǒng)計(jì)分析，結(jié)果發(fā)現(xiàn)，M1～M5個(gè) 體分 別 獲 得 764、762、675、773、800個(gè) OTU，MX1～MX5個(gè)體分別獲得 756、711、840、767、732個(gè) OTU，MX7～MX10個(gè)體分別獲得843、660、665、626個(gè)OTU。3個(gè)試驗(yàn)組間共享766個(gè)OTU，成年組專有33個(gè)OTU，青年組專有38個(gè)OTU，青年粗纖維組專有55個(gè)OTU。由此可見，隨著日齡的增加，OTU的數(shù)量略有減少，但在飼糧中添加粗纖維則會(huì)顯著增加OTU的數(shù)量。

圖1 稀釋曲線

圖2 NMDS分析結(jié)果

2.3 民豬腸道微生物NMDS分析及聚類結(jié)果 對3個(gè)試驗(yàn)組共計(jì)14個(gè)樣本進(jìn)行NMDS及聚類分析，由圖2可知，各組內(nèi)個(gè)體間的微生物群落組成相似（組內(nèi)個(gè)體的位置相對靠近）；同一組個(gè)體均聚在同一個(gè)大的分支上（圖3）。表明本試驗(yàn)中所采集的樣品重復(fù)性較好，組間菌群差異明顯。

2.3 民豬腸道微生物多樣性指數(shù)分析 本研究結(jié)果表明，14個(gè)樣本的覆蓋率均在99%以上，說明測序質(zhì)量良好，指數(shù)計(jì)算結(jié)果如表3所示。經(jīng)統(tǒng)計(jì)學(xué)t檢驗(yàn)分析后發(fā)現(xiàn)，3組間無論是物種總數(shù)還是微生物多樣性在組間均無顯著差異（P＞0.05）。

圖3 各樣本間相似度樹狀圖

2.4 民豬腸道微生物不同分類學(xué)水平上的群落組成 本研究檢測到的腸道微生物共涉及1個(gè)域（細(xì)菌），25個(gè)門，47個(gè)綱，79個(gè)目，121個(gè)科，207個(gè)屬和390個(gè)種（表4）。

表4 14個(gè)樣本在不同分類學(xué)水平上的群落組成

2.5 不同組間腸道微生物在門水平上的差異 本研究中共檢測到25個(gè)門，其中擬桿菌門（Bacteroidetes）、厚壁菌門（Firmicutes）、螺旋菌門（Spirochaetae）、變形菌門（Proteobacteria）、軟壁菌門（Tenericutes）、黏膠球星菌門（Lentisphaerae）、藍(lán)菌門（Cyanobacteria）、纖維桿菌門（Fibrobacteres）等均占有一定的比例，但其中擬桿菌門、厚壁菌門和螺旋菌門所占的比例最高，總計(jì)可達(dá)到91%～92%（圖4）。成年組與青年組個(gè)體的腸道微生物分布存在不同，而粗纖維的添加明顯改變了青年個(gè)體腸道微生物的組成情況，大幅提升了擬桿菌門所占的比例，降低了厚壁菌門和螺旋菌門所占的比例，使其菌群分布比例更接近成年個(gè)體。

表3 各樣本多樣性指數(shù)統(tǒng)計(jì)表

圖4 腸道微生物在門水平上的分布情況

圖5 腸道微生物在屬水平上的分布情況

2.5 不同組間腸道微生物在屬水平上的差異 由圖5可知，成年個(gè)體與青年個(gè)體均是密螺旋體屬（Treponema）、疣微菌科（Ruminococcaceae_uncultured）和普氏菌屬（Prevotella）占有較大優(yōu)勢，成年個(gè)體為10.58%、10.27%和10.85%，青年個(gè)體為14.60%、12.82%和7.39%。除此之外，成年個(gè)體有一個(gè)占到總數(shù)12.12%的S24-7_norank，是其腸道微生物內(nèi)含量最高的菌屬，遠(yuǎn)高于青年個(gè)體的3.75%，但此菌屬目前尚無準(zhǔn)確分類信息。可促進(jìn)纖維消化的纖維桿菌屬在成年個(gè)體腸道微生物內(nèi)占1.17%，而在青年個(gè)體內(nèi)僅為0.12%。

此外，飼糧中添加粗纖維會(huì)改變民豬的腸道微生物，與青年組相比，密螺旋體屬和疣微菌屬均顯著下降，普氏菌屬所占比例略有升高。在成年個(gè)體腸道內(nèi)高表達(dá)、目前還沒有準(zhǔn)確分類信息的S24-7_norank，在粗纖維添加組內(nèi)所占比例顯著升高，達(dá)到21.63%，是該組個(gè)體腸道微生物內(nèi)所占比例最高的菌屬，遠(yuǎn)遠(yuǎn)超過青年組（3.75%）。據(jù)此推測這一菌屬可能與粗纖維消化相關(guān)。粗纖維的添加也造成了腸道微生物內(nèi)纖維桿菌屬的增加，但增加幅度不大，達(dá)到0.29%，高于青年組（0.12%），仍低于成年組（1.17%）。

3 討 論

3.1 不同月齡民豬腸道微生物多樣性的差異 腸道微生物和疾病健康水平存在密切關(guān)系，其中菌群的多樣性是反映宿主健康水平的關(guān)鍵指標(biāo)。腸道微生物多樣性的改變通常與飲食結(jié)構(gòu)的調(diào)整以及健康狀況的改變有關(guān)，如肥胖[9]、炎癥性腸炎[10]和腸易激綜合癥等[11]。本研究結(jié)果發(fā)現(xiàn)，青年組和成年組間在腸道微生物堿基數(shù)量和序列條數(shù)方面沒有差異，但青年組個(gè)體經(jīng)質(zhì)控過濾后所獲得的有效序列數(shù)要比成年組多，說明隨著月齡的增加，腸道微生物的多樣性有下降趨勢。進(jìn)一步分析顯示，Ace值在2組間基本一致，而青年組的Shannon值略高于成年組，但未達(dá)顯著水平，這說明隨著月齡的增加，民豬腸道微生物的多樣性的確有下降趨勢。同人類一樣，新生嬰兒、成年人和老年人的腸道微生物多樣性均存在顯著差異，但成年人會(huì)在很長一段時(shí)間內(nèi)維持腸道微生物的穩(wěn)定[12]。據(jù)此推測，本研究中青年組與成年組間無顯著差異可能與民豬性成熟較早有關(guān)，50 kg的民豬已基本達(dá)到性成熟。

3.2 粗纖維對民豬腸道微生物多樣性的影響 影響腸道微生物多樣性的因素包括飲食，尤其是飲食成分中的纖維素。宿主沒有消化纖維素的酶，但可以被細(xì)菌代謝，進(jìn)而被小腸吸收。纖維素被認(rèn)為是維持腸道微生物多樣性的重要因素，而且能跨代產(chǎn)生作用。本研究結(jié)果顯示，粗纖維添加組個(gè)體經(jīng)質(zhì)控過濾后所獲得的有效序列數(shù)比青年組少，但未達(dá)到統(tǒng)計(jì)學(xué)上的顯著水平。用來估計(jì)群落中OTU數(shù)目的Ace值，也是粗纖維組少于青年組，但用來估算樣品中微生物多樣性指數(shù)的Shannon值在2個(gè)組間基本一致。說明粗纖維的添加使民豬腸道微生物多樣性出現(xiàn)了下降趨勢。這與在小鼠上的研究結(jié)果不盡相同[14]。

3.3 不同月齡民豬腸道微生物群結(jié)構(gòu)和物種豐度的差異擬桿菌門、厚壁菌門和螺旋菌門在成年組和青年組內(nèi)均占到總數(shù)的91%～92%，從高到低的順序也一致，但各自所占的比例不盡相同。緊隨其后的是變形菌門和黏膠球形菌門，占比均超過1%。纖維桿菌門在成年民豬組內(nèi)占比達(dá)到1.17%，而青年組為0.12%，這是2個(gè)組間在微生物群結(jié)構(gòu)方面明顯的不同之處。無壁菌門、藍(lán)藻菌門和其他一些門類的占比均小于1%，這種微生物群結(jié)構(gòu)與大白豬[15]相比更豐富。

在屬的水平上，成年組的疣微菌屬（Ruminococcaceae）物種豐度最高，達(dá)到112，其次是毛螺菌屬（Lachnospiraceae）、密螺旋體屬（Treponema）和普氏菌屬（Prevotella），分別為36、30、29，這4個(gè)菌屬可通過發(fā)酵飼料中不好消化的多糖和膠質(zhì)生產(chǎn)短鏈脂肪酸，短鏈脂肪酸可以調(diào)節(jié)宿主的能量平衡，使宿主免于炎癥反應(yīng)，抑制脂肪組織發(fā)育[16]。青年組的主要物種豐度與成年組的基本一致，無顯著差異。

3.4 粗纖維對民豬腸道微生物群結(jié)構(gòu)和物種豐度的影響粗纖維的添加使青年個(gè)體腸道內(nèi)擬桿菌門所占的比例由40.01%顯著上升到57.13%，厚壁菌門和螺旋菌門所占的比例均出現(xiàn)了顯著下降，腸道微生物群結(jié)構(gòu)變得與成年組更為相似。擬桿菌門和厚壁菌門都是與肥胖有關(guān)的細(xì)菌，胖豬的擬桿菌門會(huì)顯著低于瘦豬，而厚壁菌門會(huì)略高于瘦豬[17]；同時(shí)也發(fā)現(xiàn)生活在北方的人類其機(jī)體腸道中也會(huì)存在較多的厚壁菌門[18]。由此可見，粗纖維的添加使青年個(gè)體出現(xiàn)了變瘦的趨勢。在屬的水平上，青年粗纖維組Turicibacter（芽孢桿菌目下的一個(gè)屬，無準(zhǔn)確命名）物種豐度最高，達(dá)到43，其次是Alistipes（理研菌科下的一個(gè)屬，無準(zhǔn)確命名），黃色單胞菌屬（Xanthomonas）和黏膠球形菌屬（Lentisphaeria），分別為33、29和27?？梢?，粗纖維的添加不僅改變了微生物群結(jié)構(gòu)，也改變了優(yōu)勢菌種及其豐度。

4 結(jié) 論

本研究結(jié)果表明，民豬腸道內(nèi)菌群以擬桿菌門、厚壁菌門和螺旋菌門為主，隨著月齡的增加，各種菌群所占的比例會(huì)有所改變，但始終以這3種菌群為主。飼糧中粗纖維成分的添加可以改變民豬腸道微生物群結(jié)構(gòu)，使青年個(gè)體的菌群分布特征與成年個(gè)體更為相近。青年個(gè)體腸道微生物內(nèi)纖維桿菌屬的比例遠(yuǎn)低于成年個(gè)體，即使粗纖維的添加會(huì)促進(jìn)該類菌屬的小幅增加，但仍舊低于成年個(gè)體，推測青年個(gè)體對粗纖維的消化能力小于成年個(gè)體。

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